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.2021年2月；25(4):1867-1883.
doi:10.1111/jcmm.15573。 Epub 2021年1月8日。

人骨髓间充质干细胞衍生的细胞外囊泡通过miR-144-3p/CEP55途径阻止宫颈癌的进展

秦梦 1, 张宝芳 2, 张英明 三, 王树燕 三, 朱晓慧 三
附属机构

人骨髓间充质干细胞衍生的细胞外囊泡通过miR-144-3p/CEP55途径阻止宫颈癌的进展

秦梦等。 细胞与分子医学杂志. 2021年2月.

摘要

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，在中年女性中发病率和死亡率都很高。人类骨髓间充质干细胞（hBMSCs）与癌症的发生和随后的发展有关，细胞外小泡（EVs）通过传递microRNAs（miRNAs或miRs）介导细胞内通讯。本研究旨在研究EVs包裹的来源于hBMSCs的miR-144-3p可能介导宫颈癌进展的生理机制。通过RT-qPCR和Western blot分析，对宫颈癌细胞株和组织中心体蛋白55 Kd（CEP55）和miR-144-3p的表达谱进行了定量分析。在硅片分析和荧光素酶活性测定中鉴定了miR-144-3p与CEP55之间的结合亲和力。宫颈癌细胞与来源于hBMSCs的EV共同培养，这些EV经miR-144-3p模拟物或miR-144-3 p抑制剂处理。体外检测宫颈癌细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡。在体内还研究了hBMSCs-miR-144-3p对肿瘤生长的影响。宫颈癌细胞系和组织中miR-144-3p表达下调，而CEP55表达上调。miR-144-3p靶向CEP55，通过CEP55抑制宫颈癌细胞的增殖、侵袭和迁移，促进细胞凋亡。此外，携带miR-144-3p的hBMSCs衍生EV也获得了类似的结果。体内试验证实了hBMSCs衍生EVs中miR-144-3p对宫颈癌的抑瘤作用。总之，hBMSCs衍生EVs负载的miR-144-3p通过靶向抑制CEP55阻止宫颈癌的发展和进展，因此为我们提供了治疗宫颈癌的潜在治疗靶点。

关键词：55 Kd；中心体蛋白；宫颈癌；细胞外小泡；人骨髓间充质干细胞；microRNA-144-3p。

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无。

数字

图1
图1
CEP55在宫颈癌中的意义。A、 B，子宫颈癌相关微阵列数据集中显著上调基因的热图。横坐标表示样本数量，纵坐标表示基因，左树状图表示表达水平，每个立方体表示一个样本中基因的表达水平，右上角直方图表示色阶。C、 子宫颈癌相关微阵列数据集中显著上调基因的文氏分析。两个圆圈显示了两组宫颈癌相关微阵列数据集中宫颈癌样本中显著上调的基因，中间部分表示两组数据的交叉点。D、 宫颈癌样本中显著上调基因的相互作用网络。每个圆圈代表一个基因，圆圈之间的线表示两个基因之间存在相互作用。E、 根据TCGA数据库，检测CEP55在宫颈癌标本（左框图）和正常标本（右框图）中的表达。横坐标表示样本类型，纵坐标表示表达式级别。F、 通过RT-qPCR检测CEP55在宫颈癌和邻近正常组织中的表达，并与GAPDH相关。左侧图像表示癌组织中CEP55表达的检测结果，右侧图像表示癌旁正常组织中CEP55表达的监测结果。G、 相对于GAPDH，宫颈癌和邻近正常组织中CEP55蛋白的代表性蛋白质印迹及其定量（右侧）。将宫颈癌组织与邻近正常组织的数据进行配对比较t吨测试
图2
图2
CEP55的高表达与宫颈癌的发生有关。A、 通过RT-qPCR和Western blot分析测定正常宫颈上皮细胞系End1/E6E7和宫颈癌细胞系HeLa、CaSki、SiHa和ME180中CEP55的mRNA和蛋白表达，并将其归一化为GAPDH。B、 CEP55的mRNA和蛋白表达通过RT-qPCR和Western blot分析测定，并归一化为GAPDH。C、 通过Transwell分析检测SiHa细胞迁移和侵袭（比例尺=50µm）。D、 通过集落形成测定法检测SiHa细胞的集落形成。E、 通过EdU分析检测SiHa细胞增殖（比例尺=25µm）。F、 流式细胞术检测SiHa细胞凋亡。通过独立样本分析数据比较t试验两组之间进行单因素方差分析，然后进行Tukey检验*P（P）与经NC处理的End1/E6E7细胞系或SiHa细胞相比，<0.05。# P（P） < 0.05与用sh-NC处理SiHa细胞。数据显示为三个技术复制品的平均值±标准偏差
图3
图3
miR‐144‐3p的高表达对宫颈癌的发生具有抑制作用。A、 可能调节CEP55的推测miRNAs。4个椭圆表示来自4个数据库的预测结果，中间部分表示交集。B、 通过RT‐qPCR测定正常宫颈上皮细胞系End1/E6E7、宫颈癌细胞系HeLa、CaSki、SiHa和ME180（右侧）以及宫颈癌和邻近正常组织（左侧）相对于U6中miR‐144‐3p的表达。C、 通过Transwell分析检测SiHa细胞迁移和侵袭（比例尺=50µm）。D、 通过EdU分析检测SiHa细胞增殖（比例尺=25µm）。E、 集落形成实验检测SiHa细胞的集落形成。F、 流式细胞术检测SiHa细胞凋亡。G、 CDK4、Cyclin D1、E-cadherin、Vimentin、Bcl-2和Bax蛋白的代表性蛋白质印迹及其在SiHa细胞中的定量，归一化为GAPDH。数据比较通过独立样本进行分析t试验两组之间进行单因素方差分析，然后进行Tukey检验*P（P）与NC处理的SiHa细胞相比，<0.05。# P（P）与用sh-NC处理的SiHa细胞相比，<0.05。数据显示为三个技术复制品的平均值±标准偏差
图4
图4
CEP55是宫颈癌中miR‐144‐3p过度表达的抑瘤效应所必需的。A、 生物信息学网站上CEP55 mRNA 3'UTR中推测的miR‐144‐3p结合位点(http://mirdb.org/). B、 经双荧光素酶报告基因分析证实，miR‐144‐3p与CEP55 mRNA的3'UTR结合。C、 CEP55的mRNA和蛋白表达通过RT-qPCR和Western blot分析测定，并归一化为GAPDH。D、 通过Transwell分析检测SiHa细胞迁移和侵袭（比例尺=50µm）。E、 通过EdU分析检测SiHa细胞增殖（比例尺=25µm）。F、 集落形成实验检测SiHa细胞的集落形成。G、 流式细胞术检测SiHa细胞凋亡。H、 CDK4、细胞周期蛋白D1、E-钙粘蛋白、波形蛋白、Bcl-2和Bax蛋白的代表性蛋白质印迹及其在SiHa细胞中的定量，标准化为GAPDH。通过独立样本分析数据比较t试验两组之间*P（P）与NC模拟物或miR‐144‐3p模拟物+NC处理的SiHa细胞相比，<0.05。# P（P）与用NC抑制剂处理的SiHa细胞相比，<0.05。数据显示为三个技术复制品的平均值±标准偏差
图5
图5
成功分离出人骨髓间充质干细胞。A、 流式细胞术检测hBMSCs表面抗原的表达。B、 光学显微镜下hBMSC的形态（比例尺=100µm）。C、 油红O染色、茜素红染色和阿尔西安蓝染色（标尺=50µm）检测hBMSCs的成脂分化（左）、成骨分化（中）和成软骨分化（右）。D、 TEM下EV的形态（比例尺=200 nm）。E、 用NTA检测EV的大小分布。F、 人骨髓基质干细胞EV标志蛋白的典型Western blot及其定量
图6
图6
miR‐144‐3p可以通过来源于hBMSCs的EVs转移到宫颈癌细胞中。A、 通过RT-qPCR测定细胞中miR-144-3p相对于U6的表达。B、 荧光显微镜下hBMSCs和宫颈癌细胞中的miR‐144‐3p‐Cy3（比例尺=20µm）。C、 通过RT-qPCR分别测定细胞中相对于U6和GAPDH的miR‐144‐3p和CEP55的表达。D、 CEP55蛋白的代表性蛋白质印迹及其在细胞中的定量，按GAPDH标准化。通过独立样本分析数据比较t试验两组之间进行单因素方差分析，然后进行Tukey检验*P（P）与miR‐NC或NC治疗的hBMSC相比，<0.05。# P（P）与NC处理的EV相比，<0.05。数据显示为三个技术重复的平均值±标准差
图7
图7
由人骨髓基质干细胞分泌的EVs包裹的miR‐144‐3p在宫颈癌中起到抑癌作用。A、 通过Transwell分析检测SiHa细胞迁移和侵袭（比例尺=50µm）。B、 通过EdU分析检测SiHa细胞增殖（比例尺=25µm）。C、 集落形成实验检测SiHa细胞的集落形成。D、 流式细胞术检测SiHa细胞凋亡。E、 CDK4、Cyclin D1、E-cadherin、Vimentin、Bcl-2和Bax蛋白的代表性蛋白质印迹及其在SiHa细胞中的定量，归一化为GAPDH。通过独立样本分析数据比较t试验两组之间*P（P）与EVs‐NC处理的SiHa细胞相比，<0.05。数据显示为三个技术复制品的平均值±标准偏差
图8
图8
miR‐144‐3p与hBMSCs在体内对宫颈癌发挥协同抑瘤作用。A、 每7天测量一次裸鼠子宫颈癌异种移植瘤的生长情况。B、 免疫组织化学检测肿瘤组织中CD31、CEP55和Ki67蛋白的阳性表达（比例尺=25µm）。C、 CEP55和Ki67蛋白的代表性蛋白质印迹及其在肿瘤组织中的定量，按照GAPDH标准化。D、 通过TUNEL分析检测肿瘤组织中的细胞凋亡（比例尺=25µm）。通过独立样本分析数据比较t试验两组之间*P（P）与EVs‐NC治疗的裸鼠相比，<0.05。数据显示为三个技术复制品的平均值±标准偏差
图9
图9
miR‐144‐3p与人骨髓基质干细胞结合的功能和机制的图解。miR-144-3p可以转移到宫颈癌细胞中通过hBMSC衍生电动汽车。在宫颈癌细胞中，miR‐144‐3p对宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭具有抑制作用，其机制取决于与CEP55的靶向关系
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