跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2021年1月8日10:e63545。
doi:10.7554/eLife.63545。

Shprintzen-Goldberg综合征SKI突变通过SKI稳定导致TGF-β反应减弱

伊利亚·戈里 1, 罗杰·乔治 2, 安德鲁·G·珀基斯 2, 斯蒂芬妮·斯特罗布克 3, 丽贝卡·A·兰德尔 1, Roksana Ogrodowicz公司 2, 弗吉尼亚·卡米尼亚克 4, 劳伦斯·费弗尔 4, 迪拉·乔希 5, Svend Kjr公司 2, 卡罗琳·S·希尔 1
附属公司

Shprintzen-Goldberg综合征SKI突变通过SKI稳定导致TGF-β反应减弱

伊利亚·戈里等。 埃利夫. .

摘要

Shprintzen-Goldberg综合征（SGS）是一种多系统结缔组织疾病，与Marfan和Loeys-Dietz综合征有相当大的临床重叠。这些综合征通常与TGF-β信号增强有关。在SGS患者中，杂合点突变被映射到转录共抑制因子SKI，SKI是TGF-β信号的负调控因子，在配体刺激后迅速降解。然而，这些突变的分子后果尚不清楚。在这里，我们结合结构生物学、基因组编辑和生物化学来证明SKI中的SGS突变取消了其与磷酸化SMAD2和SMAD3的结合。这导致SKI稳定，从而降低表达SGS突变的敲除细胞和SGS患者成纤维细胞中的TGF-β反应。因此，我们揭示SGS与TGF-β诱导的转录反应的减弱有关，而不是增强，这对其他马凡相关综合征具有重要意义。

关键词：激活素；马凡综合征；滑雪板；SMAD；Shprintzen-Goldberg综合征；转化生长因子-β；生物化学；化学生物学；染色体；基因表达；人类。

PubMed免责声明

利益冲突声明

IG、RG、AP、SS、RR、RO、VC、LF、DJ、SK、CH未宣布竞争利益

数字

图1。
图1.SMAD2或SMAD3和SMAD4对SKI和SKIL降级的要求。
(A和C)亲本HEK293T细胞系和两个单独的SMAD4敲除克隆(A类)或两个单独的SMAD2、SMAD3敲除克隆，或两个SMAD2和SMAD3双敲除克隆(C类)用10μM SB-431542培养过夜，洗净，然后用含有SB-4315402或20 ng/ml Activin A的全培养基培养1小时，如图所示。用所示抗体对全细胞提取物进行免疫印迹。(B类)除用2 ng/ml TGF-β代替Activin A处理1小时外，父母的HaCaT和四个单独的SMAD4基因敲除克隆均按上述方法处理。使用所示抗体对核裂解物进行免疫印迹。SB，SB-431542；A、 激活素A；T、 转化生长因子-β；S2、SMAD2；S3、SMAD3；S2/3、SMAD2和SMAD3；S4、SMAD4；KO，击倒；dKO，两次击倒。
图1——图补充1。
图1-图补充1。SMAD4对TGF-β/Activin诱导的转录反应至关重要。
(A和B)HEK293吨(A类)或HaCaT(B类)用CAGA瞬时转染SMAD4敲除细胞的亲代细胞和单个克隆12-荧光素酶和TK-雷尼拉作为内部对照物，以及表达人类SMAD4的质粒，如图所示(A和B). 细胞与含0.5%胎牛血清的培养基孵育过夜，然后用20 ng/ml激活素处理(A类)或2 ng/ml TGF-β(B类)8小时。制备细胞裂解物，并测量荧光素酶/肾素活性。绘制了三个独立实验的平均值±SEM。p值来自带Tukey事后校正的单向方差分析*p<0.05***p＜0.001****p<0.0001。(C类)HaCaT亲本和四个SMAD4敲除细胞的独立克隆未经处理或与2 ng/ml TGF-β或20 ng/ml BMP4孵育1小时(SMAD7型,6月,标识1、和标识3)或6小时(SERPINE1系列和技能). 提取总RNA并使用qPCR评估所示基因的mRNA水平。数据是三个或四个实验±SEM的平均值。p值来自带Tukey事后校正的单向方差分析**p<0.01***p<0.001****p<0.0001。Par，父母；S4 KO，SMAD4击倒。
图2。
图2 SMAD4在TGF-β诱导的SKIL降解中的作用特征。
(A–C)用EGFP单独或EGFP SMAD4（WT）或四种不同的EGFP-SMAD4突变体（D351H、D537Y，消除与R-SMAD的相互作用，以及A433E和I435Y，不与SKIL相互作用）稳定转染HaCaT SMAD4敲除（S4 KO）细胞。(A类)用10µM SB-431542培养细胞过夜，洗净并用25μM MG-132预培养3小时，然后用10μM SB-43542或2 ng/ml TGF-β处理1小时。用GFP-trap琼脂糖珠免疫沉淀（IP）全细胞提取物。使用显示的抗体对IP进行免疫印迹。输入如下所示。(B类)核裂解物由HaCaT S4 KO细胞制备，该细胞稳定转染EGFP或EGFP-SMAD4构建物，如图所示，按照(A类)，但没有MG-132步骤，并使用所示抗体进行免疫印迹。右侧的量化是五个独立实验的归一化平均值±SEM。定量表达为相对于SB-431542处理的S4 KO细胞的倍数变化。(C类)EGFP阳性S4-KO拯救细胞系中SKIL水平(B类)流式细胞仪检测。每个面板都显示了所示处理条件的叠加。红线表示SB-431542处理的样品，而蓝线表示TGF-β处理的样品。数量显示在右下角。对于每组，对SB-431542处理样品归一化的中值荧光强度百分比进行量化。数据是五个独立实验的平均值±SEM。p值来自Sidak事后校正的单向方差分析*p<0.05****p<0.0001。SB，SB-431542；T、 转化生长因子-β。
图2——图补充1。
图2-图补充1。SMAD4突变体与WT SMAD4相比的转录活性。
(A类)用单独的EGFP（S4 KO）稳定转染的亲本HaCaT，SMAD4敲除克隆2，或用野生型SMAD4的EGFP融合或四个指示的SMAD4突变体用CAGA瞬时转染12-荧光素酶与TK-Renilla一起作为内部控制。细胞未经处理或用2 ng/ml TGF-β处理8小时。在全细胞裂解物上测量荧光素酶/肾素活性。绘制的是四个独立实验的平均值±SEM。p值来自带Tukey事后校正的单向方差分析****p<0.0001。(B类)稳定转染的亲代HaCaT和SMAD4敲除克隆2细胞(A类)用10μM SB-431542培养过夜，洗净，然后用SB-4315402（SB）或2 ng/ml TGF-β（T）再处理6小时。提取总RNA并对显示的基因进行qPCR。绘制了四个独立实验的平均值±SEM。p值来自Sidak事后检验的双向方差分析*p<0.05**p<0.01***p<0.001****p<0.0001。(C类)用10μM SB-431542孵育1小时或用2 ng/ml TGF-β治疗1小时后，用流式细胞仪测定亲代HaCaT细胞中的SKIL水平。面板显示了指示处理条件的叠加。红线表示SB-431542处理的样品，而蓝线表示TGF-β处理的样品。
图3。
图3 TGF-β诱导的SKIL降解可视化。
HaCaT SMAD4敲除（S4 KO）细胞或稳定表达EGFP SMAD4 WT或EGFP SMAD4突变体的细胞与10μM SB-431542孵育过夜，洗净，并与10μM SB-4315402或2 ng/ml TGF-β孵育1小时。细胞固定并染色EGFP（用于SMAD4）、SKIL，用DAPI（蓝色）标记细胞核，并通过共焦显微镜成像。合并合并SKIL、SMAD4和DAPI染色。箭头表示EGFP表达细胞和相应水平的核SKIL。比例尺对应于50µm。
图4。
图4 SGS突变抑制SKI与SMAD2/3的结合。
(A和B)用2 ng/ml TGF-β处理或不处理HaCaT细胞。对全细胞提取物进行肽下拉分析，并用所示抗体对下拉进行免疫印迹。输入显示在右侧。(A类)使用与氨基酸11–45对应的野生型（WT）SKI肽或包含SGS点突变的野生型SKI肽，如红色所示。(B类)使用与SKI中SGS突变对应的氨基酸80-120或含有突变（红色）的WT SKIL肽。(C类)WT SKI肽或含有SGS点突变的肽用于SMAD2-小鼠胚胎成纤维细胞全细胞提取物的下拉试验，该成纤维细胞仅表达SMAD2的MH2结构域（MEF SMAD2Δex2)（Das等人，2009年），用2 ng/ml TGF-β治疗。未经处理的样品仅显示为WT SKI肽。显示了PSMAD2免疫印迹。(D类)将磷酸化SMAD2 MH2结构域的重组三聚体用于WT和G34D SKI肽的肽下拉分析。PSMAD2免疫印迹显示，输入位于右侧。(E类)用重组PSMAD3–SMAD4复合物探测在氨基酸19和35之间的所有残基突变的SKI肽（氨基酸11-45）的突变肽阵列，该复合物使用与Alexa 488缀合的SMAD2/3抗体进行可视化。在每一行中，所示氨基酸被替换为其他氨基酸。显示了一个典型示例。有关肽阵列的量化，请参见图4图补遗1C和图4源数据2。
图4——图补充1。
图4补充了SKI中的1..SGS突变。
(A类)显示了人类SKI的前317个氨基酸与小鼠SKI和人类SKIL的相应区域的对齐。关键域显示：粉红色对应于R-SMAD结合域；蓝色，DHD域；紫色，砂域。SGS突变用箭头表示。(B类)在肽下拉分析中，使用HaCaT细胞的全细胞提取物（经或不经2 ng/ml TGF-β处理）对与氨基酸11–51和截短型相对应的SKI肽进行分析。使用显示的抗体对下拉框进行免疫印迹。输入显示在右侧。(C类)SKI肽（氨基酸11-45）突变肽阵列的量化，其代表性如图4E所示。减去背景后，将每个强度测量值归一化为60个WT肽阳性对照的平均强度，从60个阴性对照（截短的SKI肽C，如B类). 所示值是每个突变肽的平均归一化强度。另请参见图4源数据2。
图5。
图5 PSMAD2 MH2结构域和N末端SKI肽的晶体结构。
(A类)磷酸化SMAD2 MH2结构域三聚体（三个单体以亮绿色、青色和橄榄色显示）与N-末端SKI肽氨基酸11–45（品红色）的晶体结构。将显示功能区表示。C端磷酸盐以球状和棒状表示（红色和洋红色）表示。(B–F)SKI绑定关键残留物特写。SKI残留物显示为洋红色，SMAD2残留物为绿色。在(B–D类)，将显示功能区表示。在(E和F)SMAD2显示为曲面表示，SKI显示为带状。(G公司)单体SMAD2 MH2结构域与ZFYVE9（以前称为SARA）肽的结构细节（Wu等人，2000年）。请注意，含有Tyr268的β1'链被锁定在疏水囊中，迫使Trp448变平，与SKI结合不兼容。(H（H）)中的结构细节(A类)表明SMAD2复合物的形成如何改变β1'链的位置，尤其是Tyr268，使Trp448翻转90°，使其与SKI残基Phe24和Pro35堆叠。
图5——图补充1。
图5-图补充1。用于结构研究的磷酸化SMAD2 MH2结构域复合物的分析。
(A类)磷酸化的SMAD2 MH2结构域的三聚体排列通过SEC-MALLS得到证实。显示了SEC-MALLS色谱图。计算的分子量为81 kDa，非常接近预期分子量78.5 kDa。(B类)磷酸化SMAD2 MH2结构域和SKI肽（氨基酸11–45）之间的相互作用通过生物层干涉法进行测量。如图所示，生物传感器加载生物素化SKI肽，并与不同浓度的磷酸化SMAD2 MH2结构域孵育。计算的K（K）d日为1.33×10−9±2.12 x10−11M(C类)磷酸化SMAD2 MH2结构域复合物与SKI N末端区域的晶体结构的数据收集和细化统计如图5A所示。
图6。
图6.HEK293T细胞中SGS突变到SKI的敲除抑制SKI降解并抑制激活素诱导的转录。
(A类)父母HEK293T和三个独立的P35S SKI敲除蛋白克隆用10μM SB-431542孵育过夜，洗净，用25μM MG-132处理3小时，然后用SB-4315402或20 ng/ml Activin A再处理1小时。用SKI抗体或单用小球（Be）免疫沉淀全细胞裂解物（IP）。使用显示的抗体对IP进行免疫印迹。输入如下所示。(B类)父母HEK293T和四个独立的P35S SKI敲除蛋白克隆与10μM SB-431542孵育过夜，冲洗干净，并与SB-4315402或20 ng/ml Activin孵育指定时间。使用所示抗体对全细胞裂解物进行免疫印迹。(C类)细胞被视为(B类)制备核裂解物，并使用野生型c-Jun SBE寡核苷酸或SMAD3–SMAD4结合位点突变的版本通过DNA下拉分析进行分析（顶面板）。输入显示在底部面板中。用CAGA稳定转染HEK293T亲代和两个独立的P35S SKI敲除克隆12-荧光素酶记者(D类)或BRE-荧光素酶记者(E类)以TK-Renilla作为内部控制。细胞用含有0.5%胎牛血清和10μM SB-431542的培养基进行血清饥饿过夜。随后，对细胞进行清洗并用激活素A处理(D类)或BMP4(E类)以指示的浓度持续8小时。制备细胞裂解物并分析荧光素酶和Renilla活性。绘制了七种方法的平均值和SEM(D类)或四个(E类)独立实验，显示荧光素酶与Renilla的比率*p<0.05**p<0.01***p<0.001****p<0.0001。p值来自Tukey事后检验的双向方差分析。A、 激活素；某人，SB-431542；Par，父母。
图6——图补充1。
图6补充图1。SKI/SKIL中R-SMAD结合域或SAND域的突变可防止配体诱导的SKI/SKII降解。
(A类)通过PCR和Sanger测序分析比较HEK293T细胞与亲代细胞中P35S SKI突变的特征。黑框表示引起所需突变的核苷酸的变化。内置更改的详细信息如下所示。(B类)HEK293T亲本和SMAD4敲除（S4 KO）细胞瞬时转染FLAG-SKIL WT或FLAG-SKEL G103V（ΔS2/3）或FLAG-SKIL R314A、T315A、H317A和W318E（ΔS4），或保持未转染状态（U）。用10μM SB-431542培养细胞过夜，然后洗净，用25μM MG-132预处理3小时，然后用SB-4315402或20 ng/ml Activin A培养1小时。用FLAG珠免疫沉淀（IP）全细胞提取物。使用显示的抗体对IP进行免疫印迹。输入如下所示。(C类)HEK293T细胞未经转染（U）或转染了如(B类). 用10μM SB-431542培养细胞过夜，然后冲洗，然后用SB-4315402或20 ng/ml Activin A处理细胞，处理时间如图所示。使用所示抗体对全细胞提取物进行免疫印迹。SB，SB-431542；A、 激活素A。
图7。
图7 SKI中的SGS突变抑制SGS患者成纤维细胞中TGF-β诱导的转录反应。
(A类)将来自一名携带WT SKI的健康受试者和两名携带L32V或SKI中ΔS94-97杂合突变的SGS患者的成纤维细胞与10μM SB-431542孵育过夜，冲洗干净，然后用SB-4315402或2 ng/ml TGF-β重新孵育至指定时间。使用所示抗体对全细胞裂解物进行免疫印迹。(B类)日志的分层聚集热图2FC值（相对于SB-431542处理的样品）显示在TGF-β处理1小时和8小时后，健康成纤维细胞和L32V SKI成纤维细胞中TGF-β反应基因的表达，通过RNA-seq分析。对每种条件下的四个生物重复进行了分析。显示的基因是那些在健康成纤维细胞中TGF-β诱导具有统计学意义，但在L32V成纤维细胞内无统计学意义的基因。(C类)与中相同的数据(B类)显示为方框图。(D类)WT SKI和突变SKI作用机制的模型。左侧面板显示未模拟的条件。在细胞核中，SKI（蓝色）与RNF111（粉红色）复合，也与SBE处的DNA结合，SMAD4（绿色）与其他转录阻遏物（褐红色）形成转录抑制复合物。在中间面板中，TGF-β/Activin刺激诱导磷酸化R-SMAD–SMAD4复合物（黄色和绿色）的形成，从而诱导RNF111降解WT SKI。这允许活性PSMAD3–SMAD4复合物结合SBE并激活转录。在右侧面板中，SGS-突变的SKI（浅蓝色）在TGF-β/Activin刺激后不会降解，因为它不能与PSMAD2或PSMAD3相互作用。因此，它仍然与DNA上的SMAD4结合，导致转录反应减弱。
图7——图补充1。
图7补充图1。SGS患者的皮肤成纤维细胞表现出TGF-β转录反应减弱。
(A类)显示了含有WT SKI的正常成纤维细胞和含有L32V SKI突变或ΔS94-97 SKI突变的SGS患者成纤维细胞的RNA-seq的主成分分析（PCA）图，如图所示处理。主成分分析（PCA）使用rlog转换读取计数来测量样本间的差异，该读取计数表示至少一个样本中一个以上的所有基因。每个条件显示四个副本。(B类)富集反应体途径常见于来源于含有WT SKI的健康受试者的成纤维细胞的时间点（SB-431542处理与1小时TGF-β或8小时TGF-β）的成对比较。(C类)通过RNA-seq分析，log2FC值（相对于SB-431542状态）的层次聚集热图显示了TGF-β治疗1小时和8小时后，健康人（WT SKI）和ΔS94-97 SKI相关成纤维细胞中TGF-？响应基因的表达。对每种条件下的四个生物重复进行了分析。显示的基因是那些在健康成纤维细胞中TGF-β诱导具有统计学意义，但在ΔS94-97成纤维细胞内无统计学意义的基因。(D类)与中相同的数据(C类)显示为方框图。
图7——图补充2。
图7补充图2。通过qPCR验证RNA-seq数据。
(A–L)将含有L32V SKI突变或ΔS94-97 SKI突变的SGS患者的健康皮肤成纤维细胞（WT SKI）和皮肤成纤维纤维细胞用10µM SB-431542处理过夜，洗净，并用SB-4315402或2 ng/ml TGF-β孵育1小时和8小时。提取总RNA，并进行RNA-seq或qPCR分析。靶基因子集的转录水平显示为来自RNA-seq数据的百万分之平均转录物（TPM）图(A、 C、E、G、I、K)或通过qPCR进行测量，并将其归一化为SB-431542处理的健康成纤维细胞(B、 D、F、H、J、L). 绘制了至少四个独立实验的平均值和SEM。p值来自Tukey的事后检验的双向方差分析*p<0.05**p<0.01***p<0.001****p<0.0001。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

  • TGF-β阻遏物SKI的突变导致Shprintzen-Goldberg综合征伴主动脉瘤。
    Doyle AJ、Doyle JJ、Bessling SL、Maragh S、Lindsay ME、Schepers D、Gillis E、Mortier G、Homfray T、Sauls K、Norris RA、Huso ND、Leahy D、Mohr DW、Caulfield MJ、Scott AF、DestréE A、Hennekam RC、Arn PH、Curry CJ、Van Laer L、McCallion AS、Loeys BL、Dietz HC。 Doyle AJ等人。 自然遗传学。2012年11月；44(11):1249-54. doi:10.1038/ng.2421。Epub 2012年9月30日。 自然遗传学。2012 PMID：23023332 免费PMC文章。
  • SKI的SMAD结合域：导致Shprintzen-Goldberg综合征的从头突变热点。
    Schepers D、Doyle AJ、Oswald G、Sparks E、Myers L、Willems PJ、Mansour S、Simpson MA、Frysira H、Maat-Kievit A、Van Minkelen R、Hoogeboom JM、Mortier GR、Titheradge H、Brueton L、Starr L、Stark Z、Ockeloen C、Lourenco CM、Blair E、Hobson E、Hurst J、Maystad I、DestréE A、Girisha KM、Miller M、Dietz HC、Loeys B、Van Laer L。 Schepers D等人。 《欧洲人类遗传学杂志》。2015年2月；23(2):224-8. doi:10.1038/ejhg.2014.61。Epub 2014年4月16日。 《欧洲人类遗传学杂志》。2015 PMID：24736733 免费PMC文章。
  • SKI和Shprintzen-Goldberg综合征的从头外显子1错义突变：两例新病例和一项临床回顾。
    Au PY、Racher HE、Graham JM Jr、Kramer N、Lowry RB、Parboosingh JS、Innes AM；加拿大福特集团。 Au PY等人。 《美国医学遗传学杂志》，2014年3月；164A（3）：676-84。doi:10.1002/ajmg.a.36340。Epub 2013年12月19日。 2014年《美国医学遗传学杂志》。 PMID：24357594 审查。
  • SKI外显子1的帧内突变导致显性Shprintzen-Goldberg综合征。
    Carmignac V、Thevenon J、Adès L、Callewaert B、Julia s、Thauvin-Robinet C、Gueneau L、Courcet JB、Lopez E、Holman K、Renard M、Plauchu H、Plessis G、De Backer J、Child A、Arno G、Duplomb L、Callier P、Aral B、Vabres P、Gigot N、Arbustini E、Grasso M、Robinson PN、Goizet C、Baumann C、Di Rocco M、Sanchez Del Pozo J、Huet F、Jondeau G、，Collod-Beroud G、Beroud C、Amiel J、Cormier-Daile V、Rivière JB、Boileau C、De Paepe A、Faivre L。 Carmignac V等人。 美国人类遗传学杂志。2012年11月2日；91(5):950-7. doi:10.1016/j.ajhg.2012.10.002。Epub 2012年10月25日。 美国人类遗传学杂志。2012 PMID：23103230 免费PMC文章。
  • 马凡综合征及相关疾病：25年的基因发现。
    Verstraeten A、Alaerts M、Van Laer L、Loeys B。 Verstraeten A等人。 哼，变种。2016年6月；37（6）：524-31。doi:10.1002/humu.22977。Epub 2016年3月14日。 哼，变种。2016 PMID：26919284 审查。
查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Afonine PV、Grosse-Kunstleve RW、Echols N、Headd JJ、Moriarty NW、Mustakimov M、Terwilliger TC、Urzhumtsev A、Zwart PH、Adams PD。使用phenix.refine实现自动晶体结构精细化。结晶学学报D辑生物结晶学。2012;68:352–367. doi:10.1010/S0907444912001308。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Anderton MJ、Mellor HR、Bell A、Sadler C、Pass M、Powell S、Steele SJ、Roberts RR、Heier A。小分子ALK5抑制剂诱导心脏瓣膜病变。毒理学病理学。2011;39:916–924. doi:10.1177/0192623311416259。-内政部-公共医学
    1. Angelov SN，Hu JH，Wei H，Airhart N，Shi M，Dichek DA。TGF-β（转化生长因子-β）信号通过不同的机制保护胸主动脉和腹主动脉免受血管紧张素Ⅱ诱导的病理损伤。动脉硬化、血栓形成和血管生物学。2017;37:2102–2113. doi:10.1161/ATVBAHA.117.309401。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bonnon C，Atanasoski S.C-健康与疾病滑雪。细胞和组织研究。2012;347:51–64. doi:10.1007/s00441-011-1180-z。-内政部-公共医学
    1. Briones-Orta MA、Levy L、Madsen CD、Das D、Erker Y、Sahai E、Hill CS。Arkadia通过调节TGF-β途径调节肿瘤转移。癌症研究。2013;73:1800–1810. doi:10.1158/0008-5472.CAN-12-1916。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

补充概念