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.2021年1月7日；17（1）：e1009277。
doi:10.1371/journal.pgen.1009277。 eCollection 2021年1月。

应力作用下CTCF稳定性和亚核定位的动态调节

贝蒂娜·雷曼 1, 费尔南多·洛佩斯·迪亚兹 1, 托姆·桑蒂萨库尔塔姆 2, 林井芳 2, Maxim N Shokhirev公司 3, Kenneth E扩散器 4, 乌里庄园 2, 贝弗利·M·艾默生 1
附属公司

应力作用下CTCF稳定性和亚核定位的动态调节

贝蒂娜·雷曼等。 公共科学图书馆-基因. .

摘要

核蛋白CCCTC-结合因子（CTCF）在染色质结构和基因调控中具有多种作用。在功能上，CTCF与数千个基因组位点相关联，并与蛋白质（如凝集素或非编码RNA）相互作用，以促进特定的转录编程。在本研究中，我们使用免疫绘图、定量实时PCR、染色质免疫沉淀序列（ChIP-seq）分析、质谱、RNA免疫沉淀序列分析（RIP-seq）和Airyscan共焦显微镜检查了人类原代细胞应激反应期间的CTCF。出乎意料的是，我们发现CTCF对正常患者源性人类乳腺上皮细胞（HMEC）中的各种形式的压力非常敏感。在HMEC中，CTCF蛋白的一个子集形成复合物，定位于富含丝氨酸/精氨酸剪接因子（SC-35）的核斑点。应激时，这种CTCF蛋白会因蛋白质稳定性的变化而迅速下调，导致SC-35核斑点中CTCF的丢失和CTCF-RNA相互作用的变化。我们的ChIP-seq分析表明，CTCF与基因组DNA的结合基本上没有变化。CTCF蛋白丰度的应激敏感库的恢复和核斑点的重新定位可以通过抑制蛋白酶体介导的降解来实现。令人惊讶的是，我们在人类多能干细胞（hPSCs）的神经元分化过程中观察到了相同的应激反应特征。CTCF形成应力敏感复合体，在神经元承诺/发育的特定阶段定位于SC-35核斑点，但不在分化神经元中。我们推测，这些特殊的CTCF复合物在RNA加工中发挥作用，RNA加工可能与核斑点附近的特定基因密切相关，有可能维持细胞处于某种分化状态，这种状态受环境信号的动态调节。CTCF的应激调节活性在持续应激、表观遗传学重新编程的HMEC和某些癌症细胞系中不偶联。这些结果揭示了CTCF在细胞分化和应激反应中的作用，以及氧化损伤诱导的癌症发生和神经退化疾病的意义。

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数字

图1
图1。在正常上皮细胞中，CTCF蛋白水平在应激时选择性下调。
（A） HMEC分离和细胞培养图；在经典HMEC/vHMEC原代培养模型中通常沉默的抑癌基因p16和RASSF1A的群体倍增和mRNA水平。培养天数显示在底部。通过RT-qPCR测量mRNA，并以相对于第1天的折叠变化表示。（B） 从患者匹配的HMEC和vHMEC中制备蛋白质提取物，并用所示抗体进行Western blot分析。HMECs（H）中CTCF、p16、p53和肌动蛋白水平的代表性Western blot分析；预选，强调HMEC（sHMEC）；和后期选择vHMEC。（C） Dox（0.4μM，24小时）基因毒性应激或H（D）急性氧化应激时CTCF水平的Western blot分析2O（运行）2HMEC（第1天）和MCF10A细胞（100 mM，30分钟）。（E） MCF10A细胞用增加浓度的H处理2O（运行）2在20分钟内诱导氧化损伤。通过蛋白质印迹法评估CTCF、ALDH1A3和肌动蛋白（作为对照）的蛋白质水平。（F） 用0.1 mM H处理HMEC2O（运行）224小时。CTCF、H2A的蛋白质水平。Z、 通过Western blotting检测EZH2、ALDH1A3、p53、Smad 3、RNA Pol II、p16和肌动蛋白。
图2
图2。CTCF蛋白水平被应激诱导的蛋白质稳定性变化下调，而HMEC中CTCF-基因组结合没有显著改变。
（A） 通过RT-qPCR分析vHMEC（第40天）中指示基因相对于HMEC（第一天）的mRNA水平。（B） H时CTCF mRNA水平的比较2O（运行）2HMEC和MCF10A细胞的处理。（C） HMEC中的氧化应激是由H诱导的2O（运行）2处理24小时或使用指定浓度的tBHQ。在蛋白酶体抑制剂MG132存在或不存在的情况下对HMEC进行应激。通过Western blotting测定CTCF、p53和肌动蛋白的蛋白水平。（D） 第1天和第10天HMEC中全基因组CTCF-DNA结合的染色质免疫沉淀ChIP-seq分析。所示为独特和常见CTCF峰值的数量。（E） CTCF峰的ChIP-seq样本信号轨迹显示所选区域在应力作用下结合位点没有变化。
图3
图3。CTCF质谱点击的功能注释聚类分析。
（A） DAVID生物信息学资源6.7用于分析CTCF细胞相互作用伙伴的质谱点击的功能注释聚类结果，强调RNA剪接和RNA结合蛋白的富集。（B） 得分最高的相关CTCF质谱点击表。
图4
图4。CTCF在正常患者衍生HMEC的SC-35阳性核斑点处形成应力敏感复合物。
（A） HMEC暴露于H2O（运行）2在存在或不存在蛋白酶体抑制剂MG132的情况下进行处理，并对抗CTCF和抗组蛋白H3抗体以及DAPI进行染色，以可视化核DNA。比例尺=3μm，（未经处理的HMEC：n=20；HMEC+50 uM H2O（运行）224小时：n=20；HMEC+50 uM小时2O（运行）224小时+MG132:n=27）。（B） HMEC暴露于细胞培养应激或H2O（运行）2治疗，固定并染色CTCF抗体和核斑点标记SC-35和DAPI，（未治疗的HMEC：n=20；HMEC延长TC应激：n=2 0；HMEC+50 uM H2O（运行）224小时：n=23）。用Airyscan显微镜对样品进行可视化，并使用Imaris软件确定Pearson共定位系数；4B组差异显著（****，P<0.0001）。（C） 直方图显示未受力的HMEC中存在CTCF相关簇（红色），H中CTCF簇关联缺失2O（运行）2-处理的HMEC和稳定应激的vHMEC。相比之下，SC-35在核斑点（“簇”）（绿色）中的分布在细胞样本中保持相对稳定。（D） CTCF与SC-35在核斑点内外共同定位的示例。（E） Western blot显示SC-35与CTCF共同免疫沉淀（未经处理的CTCF IP），而在应激条件下没有SC-35和CTCF共免疫沉淀（CTCF IPH2O（运行）2-处理）。hnRNP-K（一种已知存在于核斑点中的蛋白质）与SC-35和少量CTCF的对照免疫共沉淀证实了SC-35斑点的特性。
图5
图5。与SC35共享的压力敏感型CTCF-RNA交互作用。
（A） 维恩图显示了基于RIP-seq数据，与vHMEC相比，HMEC中与CTCF和/或SC-35相互作用的独特RNA的数量。（B） 在vHMEC中丢失但仍与SC-35结合的HMEC中CTCF与RNA的顶级相互作用列表。
图6
图6。SC-35相关核斑点处的应激敏感性CTCF复合物仅存在于神经发育的神经前体细胞（NPC）阶段。
（A） hPSC、NPC和早期神经元暴露于H2O（运行）2处理并用抗CTCF、抗SC-35和DAPI染色。用Airyscan显微镜观察样品；（NPC:n=21；NPC+H2O（运行）2：n=21）。（B） hPSC、NPC和早期神经元暴露于H2O（运行）2Western blotting分析处理和CTCF蛋白水平。还显示了不同神经元阶段的发育标记。（C） 直方图显示从NPC到H的CTCF簇形成损失（红色）2O（运行）2-经处理的NPC，而SC-35相关簇（绿色）的分布保持相对稳定。
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