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.2021年1月6日；12(1):4.
doi:10.1186/s13287-020-02072-0。

低氧hUCMSC衍生的细胞外小泡减轻慢性哮喘小鼠的过敏性气道炎症和气道重塑

李阳东 1, 王颖（音） 2, 郑婷婷 三, 延安铺 4, 马永斌 4 5, 辛琪 4, 张文哲 6, 费雪 6, 紫瑞山 6, 刘嘉萌 三, 王雪峰 7 8, 毛朝明 9
附属公司

缺氧hUCMSC衍生细胞外囊泡减轻慢性哮喘小鼠过敏性气道炎症和气道重塑

李阳东等。 干细胞研究与治疗. .

摘要

背景：作为间充质干细胞（MSCs）的主要功能形式之一，MSC衍生的细胞外囊泡（MSC-EV）在过敏性哮喘的实验模型中显示出一种替代性治疗选择。氧浓度在MSCs的自我更新、增殖和EV释放中起着重要作用，最近的一项研究发现，在缺氧条件下培养MSCs可以增强MSCs的抗哮喘作用。然而，低氧MSC-derived EVs（Hypo-EVs）在哮喘中的潜在作用尚不清楚。

方法：对BALB/c雌性小鼠进行致敏和卵清蛋白（OVA）激发，每组每周接受PBS、正常人脐带MSC-EV（Nor-EV）或Hypo-EV。治疗后，对动物实施安乐死，并收集其肺部和支气管肺泡灌洗液（BALF）。采用苏木精-伊红（HE）、周期性酸-雪夫（PAS）和马森三色染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）、Western blot分析和实时PCR等方法，对气道和肺实质的炎症和胶原纤维含量进行了研究。

结果：缺氧环境可促进人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）释放更多EV。在OVA动物中，给予Nor-EV或Hypo-EV显著改善哮喘小鼠的BALF总细胞、嗜酸性粒细胞和促炎介质（IL-4和IL-13）。此外，在抑制哮喘小鼠的气道炎症方面，Hypo-EVs通常比Nor-EVs更有效。与Nor-EV相比，Hypo-EVs进一步阻止了小鼠慢性过敏性气道重塑，同时降低了促成纤维标记物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、胶原蛋白-1和TGF-β1-p-smad2/3信号通路的表达。体外，Hypo-EVs降低TGF-β1刺激的HLF-1细胞（人肺成纤维细胞）中p-smad2/3、α-SMA和胶原蛋白-1的表达。此外，我们发现，与Nor-EV相比，miR-146a-5p在Hypo-EV中富集，并且Hypo-EV给药未调节哮喘小鼠肺组织和TGF-β1治疗的HLF-1中miR-146a-5p的表达。更重要的是，Hypo-EVs中miR-146a-5p表达的降低削弱了OVA小鼠的Hypo-EV介导的肺保护作用。

结论：我们的研究结果首次证明，缺氧hUCMSC-derived EVs可减轻慢性哮喘小鼠的过敏性气道炎症和气道重塑，可能为哮喘的治疗开辟新途径。

关键词：哮喘；胞外小泡；人脐带间充质干细胞；缺氧；肺损伤。

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利益冲突声明

没有利益冲突。

数字

图1
图1
Nor-EV和Hypo-EV的特征。一Nor-EV和Hypo-EV的透射电子显微照片。比例尺 = 200 纳米。b条Nor-EV和Hypo-EV中TSG101和HSP60表达的Western blot分析(n个 = 3). Ponceau S染色作为负荷控制。c（c）非电动汽车和亚电动汽车的NTA分析表明，两组电动汽车的尺寸范围相似(n个 = 3).d日NTA统计了来自常氧培养hUCMSCs（Nor-MSC）的EV和来自低氧处理hUCMSC（Hypo-MSC）的EVs的产生(n个 = 3） ***P（P）<0.001
图2
图2
给药Hypo-EVs可减轻OVA诱导的小鼠慢性气道炎症。一小鼠慢性过敏性气道炎症模型建立示意图。b条尾静脉给药后DIR标记EV在OVA诱导的小鼠肺中的分布（26 日注射和28 检测到的天数）。不同组小鼠肺部的代表性活体外生物发光图像（左），以及肺部相对荧光强度的量化（右；n个 = 3来自三个独立实验）。c（c）每组HE和PAS染色肺切片的代表性照片（黑条 = 200 微米）。d日,电子通过HE和PAS评分量化炎症浸润和杯状细胞增生(n个 = 6). *P（P）<0.05时**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001
图3
图3
低-EV治疗可减少BALF中的炎性细胞浸润和炎性细胞因子。一BALF中总炎性细胞（左）和嗜酸性粒细胞（右）的统计分析(n个 = 6).b条ELISA测定BALF中IL-4（左）和IL-13（右）水平的统计分析(n个 = 6). *P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001
图4
图4
低-EV治疗可预防慢性哮喘小鼠的气道和肺实质纤维化。一经Masson三色染色（黑条）染色的气道（上面板）和肺实质（下面板）的代表性显微照片 = 200 微米）。b条气道和肺实质中胶原纤维含量的百分比(n个 = 6). *P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.c（c）羟脯氨酸法测定肺组织中的胶原蛋白水平(n个 = 6). *P（P）<0.05时**P（P）<0.01, ***P（P）<0.001.d日各组肺中Col-1和α-SMA的代表性Western blots（GAPDH用作蛋白质负荷控制）(n个 = 4） 和带强度根据相应的GAPDH进行了标准化，并且这些数字表示为对照组的倍数增加*P（P）<0.05, ***P（P）<0.01 vs.PBS组#P（P）<0.05 vs.Nor-EV组
图5
图5
Hypo-EVs对肺组织和TGF-β1处理的HLF-1细胞中TGF-？磷酸化（p）-Smad2/3表达的影响。一各组肺中TGF-β1和p-Smad2/3的代表性Western blots（GAPDH用作蛋白质负荷控制）(n个 = 4） 和带强度根据相应的GAPDH进行了标准化，并且这些数字表示为对照组的倍数增加*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001 vs.PBS组；#P（P）<0.05 vs.Nor-EV组。b条通过Western blotting检测TGF-β1处理的HLF-1细胞中p-Smad2/3、α-SMA、胶原蛋白-1和GAPDH蛋白的表达(n个 = 来自三个独立实验的3个）。根据相应的GAPDH（蛋白质负载控制）对谱带强度进行标准化，并将其数量表示为对照组的倍数增加*P（P）<0.05, ***P（P）<0.001 vs.TGF-β1组#P（P）<0.05 vs.TGF-β1+Nor-EV组
图6
图6
miR-146a-5p在Hypo-EVs中的表达。一常氧和低氧条件下人脐静脉间充质干细胞HIF-1α的蛋白表达。b条实时PCR检测miR-146a-5p在人脐静脉间充质干细胞或EV中的表达(n个 = 3).c（c）对照组、PBS组、Nor-EV组和Hypo-EV组肺组织中MiR-146a-5p的表达(n个 = 6).d日实时PCR检测经Nor-EV或Hypo-EV处理的HLF-1细胞中miR-146a-5p的表达(n个 = 3). *P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001
图7
图7
在哮喘小鼠模型中，抑制低-EV中的miR-146a-5p会削弱低-EV介导的肺保护作用。一实时PCR检测miR-146a-5p在缺氧培养基中分离的EVs中的表达 nM抑制剂-146a-5p或阴性对照（NC）(n个 = 3).b条注射miR146a后肺组织中miR-145a-5p的表达杜兰特-Hypo-EV或NC-Hypo-EVs进入哮喘小鼠(n个 = 6).c（c）每组HE和PAS染色肺切片的代表性照片（黑条 = 200 微米）。d日通过HE和PAS评分量化炎症浸润和杯状细胞增生(n个 = 6).电子支气管肺泡灌洗液中总炎性细胞和嗜酸性粒细胞的统计分析(n个 = 6).（f）ELISA检测BALF中IL-4和IL-13水平的统计分析(n个 = 6).克用Masson三色染色法（黑条）染色的气道和实质的代表性显微照片 = 200 微米）。小时气道和肺实质中胶原纤维含量的百分比(n个 = 6).我各组肺中TGF-β1、p-Smad2/3、α-SMA和胶体-1的代表性蛋白质印迹(n个 = 3） 和带强度根据相应的GAPDH进行归一化，其数量表示为NC-Hypo-EV组的倍数增加。j个通过Western blotting检测TGF-β1处理的HLF-1细胞中p-Smad2/3、α-SMA和胶原蛋白-1的表达(n个 = 3). 根据相应的GAPDH对谱带强度进行标准化，其数量表示为NC-Hypo-EV组的倍数增加*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001
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