Hypoxia-sensitive long noncoding RNA CASC15 promotes lung tumorigenesis by regulating the SOX4/β-catenin axis

doi:10.1186/s13046-020-01806-5

.2021年1月6日；40(1):12.

doi:10.1186/s13046-020-01806-5。

低氧敏感性长非编码RNA CASC15通过调节SOX4/β-catenin轴促进肺肿瘤的发生

孙建勇^1 2, 熊燕露², 郭江^三, 博欣⁴, 同通江¹, 魏仁济¹, 邹元康⁵, Hong Tan公司¹, 陶江², 杨鞍钢⁶, 临洮甲⁷, 王磊（Lei Wang）⁸

附属公司

¹第四军医大学生物化学与分子生物学系癌症生物学国家重点实验室，西安，710032，陕西。
²第四军医大学唐都医院胸外科，西安，710038，陕西。
^三西安交通大学红会医院脊柱外科，西安，710054，陕西。
⁴解放军第960医院肿瘤科，泰安，271000，山东。
⁵第四军医大学职业与环境卫生系特殊作业环境危害评估与控制教育部重点实验室，西安，710032，陕西。
⁶第四军医大学免疫学系，西安，710032，陕西。
⁷第四军医大学生物化学与分子生物学系癌症生物学国家重点实验室，西安，710032，陕西。Jialth@fmmu.edu.cn。
⁸第四军医大学生物化学与分子生物学系癌症生物学国家重点实验室，西安，710032，陕西。rnawangl@yeah.net。

PMID： 33407675
预防性维修识别码： PMC7789733号
内政部： 10.1186/s13046-020-01806-5号

低氧敏感性长非编码RNA CASC15通过调节SOX4/β-catenin轴促进肺肿瘤的发生

孙建勇等。实验临床癌症研究杂志. 2021.

.2021年1月6日；40(1):12.

doi:10.1186/s13046-020-01806-5。

作者

孙建勇^1 2, 熊燕露², 郭江^三, 博欣⁴, 同通江¹, 魏仁济¹, 邹元康⁵, Hong Tan公司¹, 陶江², 杨鞍钢（Angang Yang）⁶, 临洮甲⁷, 王磊（Lei Wang）⁸

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¹第四军医大学生物化学与分子生物学系癌症生物学国家重点实验室，西安，710032，陕西。
²第四军医大学唐都医院胸外科，西安，710038，陕西。
^三西安交通大学红会医院脊柱外科，西安，710054，陕西。
⁴解放军第960医院肿瘤科，泰安，271000，山东。
⁵第四军医大学职业与环境卫生系特殊作业环境危害评估与控制教育部重点实验室，西安，710032，陕西。
⁶第四军医大学免疫学系，西安，710032，陕西。
⁷第四军医大学生物化学与分子生物学系癌症生物学国家重点实验室，西安，710032，陕西。Jialth@fmmu.edu.cn。
⁸第四军医大学生物化学与分子生物学系癌症生物学国家重点实验室，西安，710032，陕西。rnawangl@yeah.net。

PMID： 33407675
预防性维修识别码： PMC7789733号
内政部： 10.1186/s13046-020-01806-5号

摘要

背景：越来越多的证据表明，长非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）参与低氧相关癌症过程，并在使恶性细胞在缺氧应激下存活方面发挥关键作用。然而，非小细胞肺癌（NSCLC）中lncRNA和缺氧信号级联之间的分子串扰在很大程度上尚不清楚。

方法：首先，我们根据生物信息学数据确定差异表达的lncRNA肿瘤易感性候选基因15（CASC15）与非小细胞肺癌相关。采用Kaplan-Meier生存分析法探讨CASC15在肺癌中的临床意义。然后，我们通过RNAi调节非小细胞肺癌细胞系中CASC15的表达。采用CCK-8和transwell实验检测CASC15对NSCLC细胞增殖和迁移的影响。通过荧光素酶报告分析、qRT-PCR、Western blotting和染色质免疫沉淀（ChIP）验证CASC15的上游激活物和下游靶点。最后，通过RNA原位杂交（RNA-ISH）和免疫组织化学（IHC）来确认CASC15与临床样本中相关基因的遗传关系。

结果：CASC15在非小细胞肺癌组织中高表达，与预后不良密切相关。功能缺失分析表明，CASC15对NSCLC细胞的迁移和生长至关重要。机制研究表明，CASC15在NSCLC细胞中被缺氧信号转录激活。进一步分析表明，低氧诱导的CASC15反式激活主要依赖于位于CASC15启动子的低氧诱导因子1α（HIF-1α）和低氧反应元件（HREs）。CASC15促进其染色体附近基因SOX4的表达。然后SOX4发挥稳定β-catenin蛋白的作用，从而促进NSCLC细胞的增殖和迁移。HIF-1α/CASC15/SOX4/β-catenin通路在相当一部分NSCLC患者中被激活。

结论：HIF-1α/CASC15/SOX4/β-catenin轴在非小细胞肺癌的发生发展中起着重要作用。本研究提供了新的证据，表明lncRNA CASC15有望作为新的非小细胞肺癌生物标记物。阻断HIF-1α/CASC15/SOX4/β-catenin轴可以作为治疗非小细胞肺癌的潜在治疗策略。

关键词：CASC15；缺氧信号；长非编码RNA；非小细胞肺癌；SOX4。

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作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
CASC15在非小细胞肺癌中高表达，对肿瘤细胞迁移和生长至关重要。一人原发性非小细胞肺癌组织和邻近正常组织中CASC15的相对RNA水平。（地理位置：GDS3837，n个 = 每组60人）。b条根据CASC15的表达水平分层的293名肺癌患者（GEO:GSE30219）队列的总体生存概率的Kaplan-Meier曲线。**c（c）**CASC15的相对RNA水平（平均值 ± 扫描电镜，n个 = 3）在五个NSCLC细胞系（H1650、H1299、H1975、A549、H520）和一个正常人支气管上皮细胞系BEAS-2B中。d日si-CASC15或si-CASC15处理A549和H1299细胞72小时的跨阱迁移分析小时。**e（电子）**经si-Control或si-CASC15处理72小时的A549和H1299细胞的FITC-卵磷脂染色 h、然后是共焦显微成像。比例尺：30 微米。**（f）**si-CASC15处理A549和H1299细胞的细胞增殖曲线。实验在五口井中进行，并至少重复两次。克人类非小细胞肺癌异种移植模型的生物发光成像。将稳定敲除CASC15的A549或H1299细胞皮下注射到裸鼠体内（n = 每组6个）。随后，通过使用数字卡尺定期测量来监测原发性肿瘤的生长

图2
CASC15主要通过上调其邻近癌基因SOX4在NSCLC细胞中发挥促肿瘤作用。一显示基因组位置的示意图*CASC15公司*以及相邻基因。老鼠*2610307P16瑞克*该基因与*CASC15公司*人类的基因。b条SOX4和PRL的相对mRNA水平（平均值 ± 扫描电镜，n = 3）在用si-Control或si-CASC15处理48小时的A549和H1299细胞中 h.A549中SOX4蛋白水平的（C和D）Western blot分析(**c（c）**)和H1299(d日)用si-Control或si-CASC15处理48个细胞 h.用抗GAPDH抗体检测印迹，以确保装载量相等。**e（电子）**用si-Control或si-SOX4处理A549和H1299细胞的细胞增殖曲线。实验在五口井中进行，并至少重复两次。**（f）**用si-Control或si-SOX4处理A549和H1299细胞48小时的跨阱迁移分析小时。克稳定敲除CASC15或同时过表达SOX4的A549和H1299细胞的细胞增殖曲线。实验在五口井中进行，并至少重复两次。小时稳定敲除CASC15或同时过表达SOX4的A549和H1299细胞的跨阱迁移分析。我人类非小细胞肺癌异种移植模型的生物发光成像。将稳定敲除CASC15或同时过度表达SOX4的A549和H1299细胞皮下注射到裸鼠体内（n = 每组6个）。随后，通过使用数字卡尺定期测量来监测原发性肿瘤的生长

图3
CASC15通过SOX4介导的β-连环蛋白稳定作用激活NSCLC中的Wnt信号。一对转染si-CASC15或同时过表达SOX4的A549细胞进行TOP-FLASH分析。采用TOP-FLASH（TOP）或FOP-FLASH（FOP）质粒进行报告分析。pRL-TK被联合转染作为内部对照。结果显示为TOP/FOP比率。b条稳定敲除CASC15或同时过度表达SOX4的A549和H1299细胞中β-catenin蛋白水平的Western blot分析。用抗GAPDH抗体检测印迹，以确保载量相等。**c（c）**CTNNB1的相对mRNA水平（平均值 ± 扫描电镜，n = 3）在A549和H1299细胞中稳定敲除CASC15或同时过表达SOX4。d日用SOX4表达质粒或空载体对照转染稳定敲除CASC15的A549细胞。收集细胞裂解物0、60、120、180或240 放线菌酮处理后min（CHX，10 μg/ml），并通过蛋白质印迹检测β-连环蛋白水平

图4
CASC15在NSCLC中通过缺氧/HIF-1α信号转录激活。一缺氧诱导A549和H1299细胞中HIF-1α和CASC15基因表达谱的动态变化。上面板：通过Western blotting监测HIF-1α的蛋白水平，并将其归一化为GAPDH蛋白水平。数据以平均值表示 ± 来自三个独立实验的SEM，表示为正常对照组的相对折迭变化；下面板：在qRT-PCR实验中监测CASC15的RNA水平，并将其归一化为18S表达水平。b条A549和H1299细胞HIF-1α蛋白水平的Western blot分析小时。**c（c）**A549和H1299细胞中CASC15 RNA水平的qRT-PCR分析，这些细胞用si-Control或si-HIF1A处理，然后接受常氧或缺氧24小时小时。d日低氧条件下HRE-和HIF-1α依赖的CASC15反式激活。左侧面板：启动子区域示意图*CASC15公司*荧光素酶报告物分析中使用的报告体；右上角：A549细胞与荧光素酶报告子共转染*CASC15公司*带有野生型HREs（pGL3-CASC15）或突变HREs的启动子片段（pGL3-CASC15-mut1、pGL3-CASC15-mut2和pGL3-CASC15-mut1&2），或VEGF-Luc阳性对照或pGL-3阴性对照，以及Renilla-Luc报告者。转染后20小时，细胞经受常氧或缺氧24小时 h、荧光素酶活性测定；右下角：分别用上述构建物转染A549细胞，以及Renilla-luc报告人。转染后24小时，细胞缺氧24小时 h、然后进行荧光素酶活性测定。**e（电子）**常氧或缺氧条件下生长24小时A549细胞的ChIP分析 h.染色质与IgG或抗HIF-1α抗体孵育。DNA沉淀物用引物集进行PCR扩增*CASC15公司*启动程序（上面板）或*VEGFA（血管内皮生长因子）*启动子（下面板），作为阳性对照

图5
HIF-1α/CASC15/SOX4/β-catenin轴相关基因在非小细胞肺癌组织中高度表达。一TCGA-LUAD队列中HIF1A、CASC15、SOX4和CTNNB1的相对RNA水平，涉及58对匹配的肺腺癌和邻近正常肺组织。b条在含有515个肺腺癌组织的TCGA-LUAD队列中，CASC15、HIF1A、SOX4和CTNNB1表达水平之间的成对相关性

图6
HIF-1α/CASC15/SOX4/β-catenin途径在大量非小细胞肺癌患者和A549异种移植组织中激活。一由35对NSCLC和邻近正常肺组织组成的组织芯片中CASC15的代表性ISH染色和HIF-1α、SOX4和β-catenin的IHC染色。比例尺：200 微米。b条非小细胞肺癌和邻近正常肺组织中CASC15表达与HIF-1α、SOX4和β-catenin水平呈正相关。通过qRT-PCR评估LncRNA的表达，通过Western blotting评估蛋白质丰度。**c（c）**A549-shControl和A549-sh CASC15异种移植组织中CASC15的代表性ISH染色和HIF-1α、SOX4和β-catenin的IHC染色。d日非小细胞肺癌HIF-1α/CASC15/SOX4/β-catenin信号通路激活的示意模型

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