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.2021年1月；21(1):60.
doi:10.3892/etm.2020.9492。 Epub 2020年11月19日。

长非编码RNA母体表达基因通过miR-149-3p调控香烟烟雾提取物诱导的肺部炎症和人支气管上皮细胞凋亡

真武雷 1, 郭辉 2, 邹申春 2, 靖江 1, 奎玉川 3, 宋杰 3
附属公司

长非编码RNA母体表达基因通过miR-149-3p调控香烟烟雾提取物诱导的肺部炎症和人支气管上皮细胞凋亡

真武雷等。 实验治疗学. 2021年1月.

摘要

慢性阻塞性肺病（COPD）已成为一种严重的公共卫生风险。长非编码RNA（lncRNA）已被确定为参与肺细胞增殖、凋亡和炎症细胞因子表达的重要因素。以66名受试者（18名非吸烟者、24名非COPD吸烟者和28名COPD吸烟者）的外周血样本和是否用香烟烟雾提取物（CSE）处理的HBE135-E6E7细胞为研究对象。本研究的目的是探讨lncRNA母源表达基因3（MEG3）在COPD中的潜在机制。在转染microRNA（miR）-149-3p mimics、miR-阴性对照mimics，miR-149-3p抑制剂，miR-阳性对照抑制剂，靶向MEG3（si-MEG3）和si-NC（si-NC）的小干扰（si）RNA后，用逆转录定量PCR检测MEG3和microRNA-149-3p的水平，分别使用细胞计数试剂盒-8和流式细胞术检测增殖和凋亡。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达。western blotting检测B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、裂解caspase-3、裂解cascase-9、磷酸化（p）-p65、总（t）-p65，p-lkBα和t-lkBβ的蛋白水平。采用荧光素酶分析检测MEG3和miR-149-3p之间的关系。与非吸烟者和不吸烟者相比，吸烟者COPD外周血样本中LncRNA MEG3高表达，而miR-149-3p表达下调。与未经处理的人类支气管上皮（HBE）细胞相比，香烟烟雾提取物（CSE）处理的HBE细胞中MEG3的表达增加。与转染si-NC的CSE处理HBE细胞相比，MEG3敲除促进转染si-MEG3的CSE治疗HBE细胞的增殖和抑制凋亡，并降低转染si/MEG3的CCE处理HBE细胞中IL-6、TNF-α、Bcl-2的水平，增加裂解case-3和裂解case-9。荧光素酶分析表明miR-149-3p具有MEG3的靶位点。MEG3通过海绵化CSE处理的HBE细胞中的miR-149-3p来调节NF-κB信号通路。总之，这些发现表明，MEG3通过miR-149-3p调节CSE处理的HBE细胞中NF-κB信号通路，从而促进增殖并抑制凋亡。这些结果为进一步验证和理解COPD的分子基础提供了见解。

关键词：细胞凋亡；慢性阻塞性肺疾病；炎症；长非编码RNA母体表达基因3；microRNA-149-3p。

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数字

图1
图1
COPD患者和CSE诱导细胞血样中长非编码RNA MEG3和miR-149-3p的相对mRNA表达水平。采用RT-qPCR方法检测非吸烟者、吸烟者和吸烟者COPD患者MEG3和miR-149-3p（A和B）mRNA的表达水平。（C） 吸烟者COPD患者MEG3和miR-149-3p mRNA表达水平的相关性分析。（D和E）使用RT-qPCR检测未经处理（Ctrl）和CSE诱导的人支气管上皮细胞中MEG3和miR-149-3p的相对mRNA表达水平。**P<0.01。MEG3，母系表达基因3；RT-q，逆转录定量；miR，microRNA；CSE，香烟烟雾提取物；慢性阻塞性肺病。
图2
图2
MEG3敲低对CSE诱导的HBE细胞增殖、凋亡和炎性细胞因子表达的影响。用对照组（未经处理的HBE细胞）、CSE、CSE+si-NC或CSE+si-MEG3处理人支气管上皮细胞。（A） 用逆转录定量PCR检测MEG3在处理的HBE细胞中的mRNA表达。（B） 通过细胞计数试剂盒-8检测细胞增殖。（C和D）用ELISA检测IL-6和TNF-α水平。（E） 流式细胞仪检测细胞凋亡。（F） 通过western blotting检测Bcl-2、caspase-3和caspase-9的蛋白表达水平。**P<0.01。MEG3，母体表达基因3；miR，microRNA；香烟烟雾提取物；OD，光密度；PI，碘化丙啶；NC，阴性对照；白细胞介素；肿瘤坏死因子；si，小干扰RNA。
图3
图3
MEG3和miR-149-3p之间的关系。（A） DIANNA在线工具预测了MEG3和miR-149-3p的假定结合位点，MEG3的MUT序列显示为红色。（B）在与MEG3-WT或MEG3-MUT和miR-NC或miR-149-3 p模拟物共同转染的HBE细胞中评估荧光素酶活性。（C和E）用空载体和MEG3转染HBE细胞，检测MEG3或miR-149-3p的表达。（D和F）在转染si-NC、si-MEG3#1和si-MEG3#2的HBE细胞中测量MEG3或miR-149-3p的水平。**P<0.01。MEG3，母体表达基因3；miR，microRNA；CSE，香烟烟雾提取物；HBE，人支气管上皮；NC，阴性对照；si，小干扰RNA；WT，野生型；MUT，突变型。
图4
图4
MEG3对miR-149-3p介导的HBE细胞增殖、凋亡和炎症细胞因子表达的调节作用。用对照组（未经处理的HBE细胞）、CSE、CSE+抗miR-NC、CSE+miR-149-3p抑制剂、CSE+4i-MEG3、CSE+5i-MEG3+抗miR-NC或CSE+si-MEG3+miR-149-3抑制剂处理HBE细胞。（A） 用逆转录定量PCR测定处理后HBE细胞中miR-149-3p的表达。（B） 使用细胞计数试剂盒-8分析测定处理后HBE细胞的细胞增殖。（C和D）流式细胞术分析细胞凋亡。（E） 用蛋白质印迹法测定Bcl-2、caspase-3和caspase-9的蛋白水平。（F） ELISA检测IL-6和（G）TNF-α水平。**P<0.01。MEG3，母体表达基因3；miR，microRNA；香烟烟雾提取物；OD，光密度；PI，碘化丙啶；NC，阴性对照；白细胞介素；肿瘤坏死因子；si，小干扰RNA。
图5
图5
MEG3通过靶向miR-149-3p调节NF-κB信号通路。用对照组（未经处理的HBE细胞）、CSE、CSE+抗miR-NC、CSE+miR-149-3p抑制剂、CSE+4i-MEG3、CSE+5i-MEG3+抗miR-NC或CSE+si-MEG3+miR-149-3抑制剂处理HBE细胞。western blotting法检测处理细胞中p-p65、t-p65、p-IκBα、p-I kb Bα的蛋白表达水平。**P<0.01。MEG3，母体表达基因3；miR，microRNA；CSE，香烟烟雾提取物；NC，阴性对照；p、 磷酸化；t、 总量；si，小干扰RNA。
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