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.2021年2月；25(4):1911-1926.
doi:10.1111/jcmm.15866。 Epub 2020年12月22日。

骨髓间充质干细胞分泌的细胞外囊泡包裹let-7i通过KDM3A/DCLK1/FXYD3轴抑制肺癌

刘杰峰 1, 雨花峰 2, 曾新余 1, 苗河 1, 玉晶宫 1, 刘一平 三
附属公司

骨髓间充质干细胞分泌的细胞外囊泡包裹let-7i通过KDM3A/DCLK1/FXYD3轴抑制肺癌

刘杰峰等。 细胞与分子医学杂志. 2021年2月.

摘要

越来越多的证据表明，细胞外囊泡（EV）在肺癌治疗中起着至关重要的作用。因此，我们旨在研究骨髓间充质干细胞（BMSC）-EV-衍生let-7i的调节作用及其在肺癌进展中的分子机制。基于微阵列的分析用于预测肺癌相关miRNA及其下游基因。进行RT-qPCR和Western印迹分析以确定Let-7i、赖氨酸去甲基酶3A（KDM3A）、双皮质素样激酶1（DCLK1）和含FXYD结构域的离子转运调节因子3（FXYD3）的表达，然后使用双荧光素酶报告基因分析和ChIP分析来确定它们之间的关系。在进行功能丧失和获得检测后，评估let-7i、KDM3A、DCLK1和FXYD3对肺癌细胞生物学特性的影响。最后，通过裸鼠中的异种移植瘤评估裸鼠中肿瘤的生长。生物信息学分析筛选出let-7i及其下游基因KDM3A。研究结果表明，肺癌中存在KDM3A和DCLK1的高表达，let-7i和FXYD3的表达减少。KDM3A通过去除H3K9me2的甲基化来升高DCLK1。此外，DCLK1抑制FXYD3的表达。BMSC-EV-derived let-7i导致KDM3A表达下调，并逆转其在肺癌发展中的促进作用。一致地，裸鼠体内实验也证实，BMSC-EV衍生let-7i抑制了肿瘤生长。总之，我们的研究结果表明，BMSC-EV-derived let-7i通过KDM3A/DCLK1/FXYD3轴在肺癌进展中具有抑制作用，提示了肺癌治疗的一个新的分子靶点。

关键词：FXYD结构域离子转运调节因子3；骨髓间充质干细胞；双皮质素样激酶1；细胞外小泡；let-7i；肺癌；赖氨酸脱甲基酶3A。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
Let‐7i在肺癌组织和细胞中低表达。A、 微阵列GSE63805和GSE102286中差异表达的miRNA。对数折叠变化（FC）值的色标在右侧。B、 微阵列GSE63805和GSE102286中前20个miRNA的交叉点。C、 StarBase分析交叉miRNA与肺癌预后之间的关系，得出三条显著相关的miRNA生存曲线中let-7i-5p的生存曲线。D、 通过RT-qPCR测定肺癌组织中let-7i的表达（n=65）*P（P）<0.05 vs.癌旁组织。E、 用RT-qPCR测定肺癌细胞A549和H125、正常人肺成纤维细胞LL29中let-7i的表达*P（P）与LL29细胞相比<0.05。数据均为测量数据，表示为平均值±标准偏差。实验重复3次
图2
图2
BMSC‐EV‐let‐7i‐mimic对肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭具有负调控作用。A、 TEM下观察到的BMSC‐EV（比例尺=100 nm）。B、 电动汽车的尺寸分布由NTA确定。C、 通过Western blot分析测定BMSC‐EVs（5μg）和BMSC裂解物（20μg）。D、 人类肺癌细胞在24小时摄取EV的免疫荧光叠加图像（双标签；红色EV‐20%；绿色肺癌细胞；×400）。E、 通过RT‐qPCR测定BMSC‐EV和裂解上清液中Let‐7i的表达*P（P）与上清液相比<0.05。F、 通过RT-qPCR测定EVs治疗的肺癌细胞中let-7i的表达。G、 用EVs处理的肺癌细胞的增殖通过CCK8测定。H‐I，Transwell测定的EVs对肺癌细胞的迁移和侵袭（×200）*P（P）与BMSC‐EV‐mimic‐NC处理的细胞相比，<0.05#P（P）与BMSC‐EV‐抑制剂‐NC处理的细胞相比，<0.05。实验重复3次
图3
图3
BMSC‐EV衍生的let‐7i抑制KDM3A以进一步抑制肺癌的发展。A、 使用RAID、mirDIP、DIANA TOOLS、miRDB、starBase和miRWalk预测let-7i的下游基因，绘制文氏图进行交叉。B、 从let-7i下游基因和Cistrome因子获得的人类转录文氏图，交叉基因为KDM3A。C、 starBase预测的let-7i和KDM3A的结合位点。D、 双荧光素酶报告基因分析验证了let-7i和KDM3A之间的关系。E、 RT-qPCR检测肺癌组织中KDM3A的表达（n=65）*P（P）与癌旁组织相比<0.05。F、 RT-qPCR检测KDM3A在肺癌细胞A549和正常人肺成纤维细胞LL29中的表达*P（P）与LL29相比<0.05。G、 RT-qPCR检测经EVs处理的肺癌细胞中KDM3A的表达*P（P）与BMSC‐EVs处理的细胞相比，<0.05。H‐I，通过RT-qPCR测定转染经EVs处理的oe‐KDM3A的肺癌细胞中let‐7i和KDM3A表达*P（P）与oe‐NC转染的细胞相比，<0.05#P（P）与oe‐KDM3A转染的细胞相比<0.05&P（P）与转染KDM3A+EV‐抑制剂‐NC的细胞相比，差异<0.05。J、 CCK‐8测定EVs治疗肺癌细胞的增殖能力*P（P）与oe‐NC转染的细胞相比，<0.05#P（P）与oe‐KDM3A转染的细胞相比<0.05&P（P）与用oe-KDM3A+EV抑制剂-NC转染的细胞相比，<.05。K、 Transwell（×200）测定肺癌细胞的迁移和侵袭*P（P）与oe‐NC转染的细胞相比，<0.05#P（P）与oe‐KDM3A转染的细胞相比<0.05&P（P）与oe‐KDM3A+EV‐抑制剂‐NC转染的细胞相比，差异<0.05。实验重复3次
图4
图4
KDM3A促进DCLK1表达并调节肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。A、 StarBase预测肺癌中KDM3A和DCLK1表达的相关性（r=0.129，P（P）=3.91e‐03）。B、 通过MEM分析确定KDM3A和DCLK1之间的共表达关系(P（P）=4.23e‐03）。C、 通过RT-qPCR测量KDM3A在肺癌组织中的表达（n=65）*P（P）与癌旁组织相比<0.05。D&E，si-KDM3A转染肺癌细胞后KDM3A和DCLK1的表达*P（P）与转染si-NC的细胞相比<0.05。F&G，抗-H3K9me2抗体ChIP分析测定肺癌细胞转染si-KDM3A后KDM3A和DCLK1增强子区组蛋白H3K9修饰的变化*P（P）与转染si-NC的细胞相比<0.05。H、 RT-qPCR测定KDM3A和DCLK1的mRNA表达*P（P）与转染si-NC+oe-NC的细胞相比<0.05#P（P）与转染si-KDM3A+oe-NC的细胞相比，差异<0.05。一、 Western blot分析测定KDM3A和DCLK1的蛋白表达*P（P）与转染si-NC+oe-NC的细胞相比<0.05#P（P）与转染si-KDM3A+oe-NC的细胞相比，差异<0.05。J、 通过CCK‐8分析测定EVs治疗的肺癌细胞的增殖*P（P）与转染si-NC+oe-NC的细胞相比<0.05#P（P）与转染si-KDM3A+oe-NC的细胞相比，差异<0.05。K、 Transwell法测定肺癌细胞的迁移和侵袭（×200）*P（P）与转染si-NC+oe-NC的细胞相比<0.05#P（P）与转染si-KDM3A+oe-NC的细胞相比，差异<0.05。实验重复了三次
图5
图5
DCLK1能抑制FXYD3，促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。A、 StarBase预测的肺癌中DCLK1和FXYD3的表达之间的相关性（r=-0.199，P（P）=7.05e‐06）。B、 RT-qPCR检测肺癌组织和癌旁组织中FXYD3的表达（n=65）*P（P）与癌旁组织相比<0.05。C、 通过RT-qPCR测定sh-DCLK1转染后肺癌细胞中DCLK1的mRNA表达*P（P）与转染sh‐NC的细胞相比，<0.05。D、 RT-qPCR检测sh-DCLK1转染后肺癌细胞FXYD3的mRNA表达*P（P）与转染sh‐NC的细胞相比，<0.05。E、 通过Western blot分析测定转染oe-DCLK1或oe-FXYD3后肺癌细胞中FXYD的蛋白表达*P（P）与转染sh‐NC的细胞相比，<0.05。F、 CCK‐8测定了EVs治疗的肺癌细胞的增殖*P（P）与oe‐NC转染的细胞相比，<0.05#P（P）与oe-FXYD3+oe-NC转染的细胞相比，差异<0.05。G、 Transwell（×200）检测肺癌细胞的迁移和侵袭*P（P）与oe‐NC转染的细胞相比，<0.05#P（P）与oe-FXYD3+oe-NC转染的细胞相比，差异<0.05。实验重复3次
图6
图6
BMSC‐EV衍生的let-7i可以通过调节KDM3A抑制DCLK1/FXYD3轴，从而抑制肺癌的发病机制。A、 通过RT‐qPCR测定经si‐NC转染的肺癌细胞EVs处理的肺癌细胞共培养后let‐7i的表达*P（P）与转染si-NC的细胞相比<0.05&P（P）与转染si‐FXYD3+EV‐抑制剂‐NC的细胞相比，差异<0.05。B、 Western blot分析测定KDM3A、DCLK1和FXYD3蛋白表达*P（P）与转染si-NC的细胞相比<0.05#P（P）与转染si-FXYD3的细胞相比&P（P）与转染si‐FXYD3+EV‐抑制剂‐NC的细胞相比，差异<0.05。C、 CCK‐8测定EV治疗后肺癌细胞的增殖*P（P）与转染si-NC的细胞相比<0.05#P（P）与转染si-FXYD3的细胞相比&P（P）与转染si‐FXYD3+EV‐抑制剂‐NC的细胞相比，<0.05。D、 Transwell（×200）测定EV治疗后肺癌细胞的迁移和侵袭*P（P）与转染si-NC的细胞相比<0.05#P（P）与转染si-FXYD3的细胞相比&P（P）与转染si‐FXYD3+EV‐抑制剂‐NC的细胞相比，差异<0.05。E、 流式细胞术分析EV治疗后肺癌细胞凋亡*P（P）与转染si-NC的细胞相比<0.05#P（P）与转染si-FXYD的细胞相比&P（P）与si‐FXYD3+EV‐抑制剂‐NC处理的细胞相比，<0.05。实验重复3次
图7
图7
BMSC中的Let‐7i抑制裸鼠肺癌细胞的增殖和转移。A、 不同时间点裸鼠肿瘤体积的统计分析（n=6）。B&C，肿瘤代表性图片和裸鼠第30天肿瘤重量的统计分析，HE染色检测肺组织结节转移的统计分析（×400）。E&F，通过RT-qPCR和Western blot分析测定肿瘤组织中let-7i、KDM3A、DCLK1和FXYD3的表达。G、 通过Western blot分析测定肿瘤组织中波形蛋白、N钙粘蛋白和E钙粘蛋白的表达*P（P）与模型小鼠相比<0.05#P（P）与经si‐FXYD3治疗的裸鼠相比，<0.05。数据均为测量数据，表示为平均值±标准偏差
图8
图8
BMSC‐EV衍生的let-7i通过降低FXYD3抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭通过通过抑制KDM3A升高DCLK1，从而有效抑制肺癌的发展
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