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.2021年5月；15(5):1289-1307.
doi:10.1002/1878-0261.12890。 Epub 2021年1月4日。

在三阴性乳腺癌细胞中合成的dsRNA类似物抑制TGF-β的抗热作用

Yusuke Tamura公司 1, 森川正人 1, Ryo Tanabe先生 1, Kohei Miyazono先生 1, 大佐小菊 1
附属机构

在三阴性乳腺癌细胞中合成的dsRNA类似物抑制TGF-β的抗热作用

Yusuke Tamura公司等。 Mol Oncol公司. 2021年5月.

摘要

创新治疗模式的开发将解决三阴性乳腺癌（TNBC）治疗中尚未满足的临床需求。在癌细胞中激活维甲酸诱导的基因-I（RIG-I）样受体（RLRs），如黑色素瘤分化相关基因5（MDA5）和RIG-I，可以通过诱导细胞死亡来抑制肿瘤进展。polyI:C是一种传统使用的合成双链RNA（dsRNA）类似物，可激活RLR，其转染已在临床试验中进行了评估。然而，RLR抑制肿瘤的详细机制，尤其是与其他信号通路的相互作用，仍不清楚。在这里，我们发现polyI:C转染以MDA5-和RIG-I依赖的方式抑制转化生长因子-β（TGF-β）信号。我们发现，polyI:C对TGF-β信号的抑制促进了癌细胞的死亡，而组成活性Smad3的强制表达则减弱了肿瘤细胞的死亡。更详细的分析表明，polyI:C转染导致的细胞死亡表现出与凋亡不同的凋亡特征。polyI:C转染的治疗效果也通过小鼠模型证明。这些结果表明，肿瘤内注射polyI:C和相关dsRNA类似物可能通过抑制TGF-β的抗热刺功能来治疗TNBC。

关键词：RLR；转化生长因子-β；TNBC；聚I:C；焦下垂。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
PolyI:C通过RIG‐I样受体抑制TGF‐β信号传导。（A） 在Hs578T细胞中转染polyI:C 7.5小时后磷酸化IRF3的免疫印迹。IB：免疫印迹法。（B） polyI:C（1μg·mL）的影响−1)通过TGF-β在Hs578T细胞中激活Smad3。polyI:C转染12 h后，用TGF-β（1 ng·mL）刺激细胞−1)1.5小时后收获。显示了两个独立实验的代表性数据。（C） qRT‐PCR分析ZEB1、LRRC15、和PMEPA1项目用TGF-β刺激Hs578T细胞并转染或不转染polyI:C后的表达−1)，用TGF-β（1 ng·mL）刺激细胞−1)持续6小时。表达水平标准化为TBP（待定）表达式。数据显示为三个生物复制样品的平均值。错误栏指示SD**P（P） < 0.01, ***P（P）<0.001，n.s.：通过Tukey–Kramer检验，不显著。（D，E）MDA5和RIG‐I基因失活对polyI:C抑制TGF-β信号传导的影响。使用Hs578T‐Cas9细胞组成性表达靶向MDA5和RIG‐I基因的gRNA或非靶向对照gRNA进行分析。（D） polyI:C转染12小时后（1μg·mL−1)，用TGF-β（1 ng·mL）刺激细胞−1)持续1.5小时。MDA5和RIG‐I的免疫印迹显示了基因失活效率。通过磷酸化Smad3的免疫印迹法评估TGF-β信号的激活。给出了三个独立实验的代表性数据。（E） qRT‐PCR分析ZEB1、LRRC15、和PMEPA1项目用TGF‐β刺激Hs578T‐Cas9细胞并转染或不转染polyI:C后的表达−1)，用TGF-β（1 ng·mL）刺激细胞−1)持续6小时。数据显示为两次生物复制的平均值。错误栏指示SD。
图2
图2
PolyI:C通过抑制TGF-β信号传导加速细胞死亡。强制表达组成活性Smad3（caSmad3）对polyI:C诱导的细胞死亡的影响。用polyI:C（1μg·mL）转染表达HA（对照）或caSmad3的Hs578T细胞−1). 转染后12小时，用无血清培养基饥饿细胞，然后用TGF-β（1 ng·mL）刺激细胞−1)或未经治疗。饥饿36小时后，用以下实验对细胞进行分析。（A） Hs578T细胞的相位对比显微图像显示了polyI:C转染和caSmad3表达的效果。比例尺，200μm。（B，C）用annexin V‐APC和PI染色的polyI:C转染的Hs578T细胞的流式细胞术分析。显示了前向散射（FSC）门控和侧向散射（SSC）门限细胞中膜联蛋白V阳性和PI阳性细胞的百分比。显示了四个生物复制样品的代表性数据（B）和平均值（C）。错误栏指示SD***P（P）经Tukey–Kramer检验<0.001。
图3
图3
聚I：C诱导细胞死亡的特征。（A，B）经或未经Z‐VAD‐FMK处理的polyI:C转染细胞的流式细胞术分析。在polyI:C转染之前，用Z‐VAD‐FMK处理Hs578T‐HA细胞。转染后12小时，将培养基改为含有或不含有Z‐VAD‐FMK的无血清培养基。在血清饥饿36小时后收集细胞，并用膜联蛋白V‐APC和PI染色。显示了FSC门控和SSC门控细胞中膜联蛋白V阳性和PI阳性细胞的百分比。数据来自面板（B）中的两个生物复制样品。（C） polyI:C转染的Hs578T-HA细胞的相位对比显微成像。箭头表示细胞肿胀。转染12小时后，将培养基更换为无血清培养基。在血清饥饿36小时后对细胞进行分析。比例尺，50μm。（D） 转染polyI:C（1μg·mL）的Hs578T细胞释放LDH的百分比−1)在转染后的指定时间点。数据显示为两个生物复制样品的平均值。误差条表示转染polyI:C（1μg·mL）后GSDME和GSDMD的SD（E）免疫印迹−1)在Hs578T细胞中持续指定时间。转染12小时后，将培养基更换为无血清培养基。GSDMD和GSDME条带的相同性通过GSDMD敲除和GSDME敲除Hs578T细胞和经LPS（10μg·mL）引物的THP1细胞得到确认−1，48 h），并用尼葛酸处理（20μ米，2小时）。显示了两个独立实验的代表性数据。
图4
图4
polyI:C转染和TGF-β信号传导诱导的Caspase 3依赖性pyroptosis。（A，B）polyI:C转染前（1μg·mL−1)在Hs578T‐HA细胞中，向细胞中添加Z‐DEVD‐FMK。转染12小时后，将培养基更换为无血清培养基，添加或不添加Z‐DEVD‐FMK。（A） 血清饥饿36 h后，用annexin V‐APC和PI染色进行流式细胞术分析。（B） 在血清饥饿12 h后，通过免疫印迹分析细胞GSDME。数据来自两个生物复制样品，并显示了代表性数据。（C） 用polyI:C转染Hs578T‐HA或Hs578 T‐caSmad3细胞后，使用Caspase‐Glo 3/7分析系统评估Caspase 3/7活性。转染12小时后，将培养基更换为无血清培养基。检测在血清饥饿后12小时进行。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3/7活性与存活的细胞数一致。数据显示为三个生物复制样本的平均值，误差条表示SD**P（P） < 0.01, ***P（P）经Tukey–Kramer检验<0.001。（D） 用polyI:C（1μg·mL）转染Hs578T‐HA或Hs578 T‐caSmad3细胞后对GSDME进行免疫印迹−1)在指定的时间点。显示了三个独立实验的代表性数据。（E） 用polyI:C（1μg·mL）转染Hs578T‐HA或Hs578 T‐caSmad3细胞后释放的LDH百分比−1)在指定的时间点。数据显示为四个生物复制样品的平均值。错误条，SD*P（P） < 0.05, **P（P）经Tukey–Kramer检验<0.01。（F） GSDME表达（非TNBC细胞系，n个 = 22; 与TNBC细胞系相比，n个=24）存入CCLE数据库。红色方块对应于Hs578T细胞***P（P）<0.001（学生）t吨‐测试。
图5
图5
polyI:C诱导的Noxa表达被TGF-β信号部分抑制。（A） 用I型TGF-β受体激酶抑制剂LY364947处理36 h后，对annexin V‐APC和PI染色的Hs578T-HA细胞进行流式细胞术分析。数据来自无血清条件下的细胞。（B） Noxa编码的qRT‐PCR分析PMAIP1项目用TGF-β刺激Hs578T‐Cas9细胞表达MDA5和RIG‐I gRNAs，并转染或不转染polyI:C−1)，用TGF-β（1 ng·mL）刺激细胞−1)持续6小时。数据显示为两个生物复制样品的平均值。误差条，SD。（C）qRT‐PCR分析PMAIP1项目polyI:C（1μg·mL）转染12小时后在Hs578T‐HA或Hs578T‐caSmad3细胞中的表达−1). 表达水平标准化为TBP（待定）表达式。数据显示为两个生物复制样品的平均值。错误栏，SD.（D）Smad2绑定在PMAIP1项目轨迹。激活素A（50 ng·mL）处理的Hs578T细胞的Smad2 ChIP‐seq数据−1)使用1.5小时（GEO，登录号GSM3301952）。
图6
图6
PolyI:C诱导4T1细胞死亡。（A） polyI:C转染和TGF-β刺激后4T1细胞磷酸化Smad3的免疫印迹。polyI:C转染12小时后（1μg·mL−1)，用TGF-β（1 ng·mL）刺激细胞−1)在指定的时间内。通过磷酸化Smad3的免疫印迹法评估TGF-β信号的激活。显示了两个独立实验的代表性数据。（B） polyI:C转染的4T1-HA细胞的相位对比显微成像。箭头表示肿胀的细胞。polyI:C转染12小时后（1μg·mL−1)，培养基改为无血清培养基。在血清饥饿36小时后对细胞进行分析。比例尺，50μm。（C，D）caSmad3过度表达对polyI:C诱导的细胞死亡的影响。表达HA（对照）或caSmad3的4T1细胞经或不经Z‐VAD‐FMK（50μ米)用polyI:C（1μg·mL）转染−1). 转染12小时后，将培养基更换为无血清培养基，添加或不添加Z‐VAD‐FMK。在更换培养基36小时后，使用annexin V‐APC和PI染色通过流式细胞仪对细胞进行分析。显示了FSC门控和SSC门控细胞中膜联蛋白V阳性和PI阳性细胞的百分比。在面板（D）中，显示了从三个独立实验中获得的数据。（E） 用polyI:C（1μg·mL）转染24 h后4T1-HA或4T1-caSmad3细胞中GSDME的免疫印迹−1). 显示了生物复制样品的代表性数据。（F，G）polyI:C转染的抗肿瘤作用体内在第0天将4T1细胞接种在乳腺脂肪垫中的BALB/c小鼠在第10、13、17和20天进行瘤内转染polyI:c（20μg/小鼠）。显示了每只小鼠的肿瘤体积（F）和预定终点或第21天（G）的肿瘤重量。数据是从三个独立的实验中获得的（每种情况下总共有7只小鼠）。一只在第20天注射polyI:C的小鼠死于未知原因，并被排除在（G）中的评估之外*P（P）<0.05（学生）t吨‐测试。（H，I）在有或没有polyI:C处理的接种4T1肿瘤样品中细胞核中pSmad3信号的免疫荧光分析。使用带有DAPI的pSmad3抗体对从小组（F）和（G）中的两只小鼠获得的肿瘤样本进行染色。每个样品从12个显微场获得显微图像。（H） 显示了经或未经polyI:C处理的同型对照和pSmad3的代表性显微图像。比例尺，50μm。（一） 绘制了核pSmad3在每个微观场中归一化为核信号区的荧光强度(n个 = 24). 误差条，SD***P（P）<0.001（学生）t吨‐测试。
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