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.2021年1月：63:103138。
doi:10.1016/j.ebiom.2020.103138。 Epub 2020年12月17日。

染色体22q11.2缺失导致多巴胺能神经元依赖PERK的脆弱性

有口幸子 1, Emiko Shishido先生 2, Itaru Kushima公司 三, 铃木俊彦 4, 斋藤隆夫 5, 阿苏·阿伊巴 5, 森大辅 6, 诺里奥·奥扎基 7
附属公司

染色体22q11.2缺失导致多巴胺能神经元依赖PERK的脆弱性

有口幸子等。 EBioMedicine公司. 2021年1月.

摘要

背景：染色体22q11.2缺失是各种神经精神疾病的极高危遗传因素；然而，22q11.2缺失相关的人类脑病理学在细胞和分子水平上仍不清楚。

方法：我们从健康对照组（对照组）和22q11.2缺失患者（22DS组）中生成iPS细胞，并将其分化为多巴胺能神经元。进行半定量蛋白质组分析以比较两组。接下来，我们进行了分子、细胞生物学和药理学分析。

调查结果：半定量蛋白质组分析确定“内质网（ER）中的蛋白质加工”是22DS组中变化最大的途径。特别是，我们发现22DS组蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）的表达及其活性存在严重缺陷。22q11.2缺失小鼠模型的中脑也显示PERK表达降低。22DS组表现出特征性表型，包括对内质网应激耐受性差、F-actin动力学异常和蛋白质合成减少。通过对PERK活性的药理操作和PERK缺陷多巴胺能神经元的现象复制，一些表型被挽救。我们最后发现DGCR14与PERK表达减少相关。

解释：我们的发现使我们得出结论，22q11.2缺失导致多巴胺能神经元的各种脆弱性，依赖于PERK功能障碍。

基金：本研究由AMED资助，资助号为JP20dm0107087、JP20dm0207075、JP20ak0101113、JP20dk0307081和JP18dm0207004h0005；MEXT KAKENHI，批准号：16K19760、19K08015、18H04040和18K19511；Uehara纪念基金会，批准号：201810122；2019年iPS日本研究院拨款。

关键词：22q11.2删除；多巴胺能神经元；神经精神障碍；PERK公司；iPS细胞。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益声明N.Ozaki博士获得了住友大日本制药有限公司、大冢控股有限公司、辉瑞日本公司、KAITEKI研究所有限公司、卫材有限公司、Astellas、明治精工制药有限公司和Janssen Pharmaceutical K.K.的研究支持或演讲者酬金，或担任过这些公司的顾问。，和大正药业有限公司，在提交的工作之外。

数字

图1
图1
22q11.2DS iPSC衍生多巴胺能神经元的特征。（a） 多巴胺能神经元分化的示意图。（b） TH和βIII-管蛋白免疫染色的多巴胺能神经元代表性图像（第24天）。图像中的黄色比例尺代表50μm。白色箭头表示TH-阴性、βIII-管蛋白阳性（+）神经元。（c） 通过量化第24天TH+与βIII-管蛋白+细胞的比率分析多巴胺能神经元分化效率。条形代表平均值±SE。分析了五个领域。（d） 蛋白质组分析示意图。DA神经元=多巴胺能神经元。（e） KEGG通路分析。使用的蛋白质显示出大于10的倍数变化（FC）第页<0.05（对照组vs.22DS）。（f） 内质网应激下的细胞存活率。控制：n=12（控制1，n=4；控制2，n=5；控制3，n=6）；22DS:n=30（22DS1_1，n=4；22DS1_ 2，n=4。这些图表示平均值±标准偏差*第页 < 0.05, **第页<0.01与对照组未服用中药相比，††第页<0.001 vs.在22DS组中没有TCM。（g） 免疫染色的裂解钙蛋白酶3+细胞的代表性图像。白色箭头表示切割的钙离子3+细胞。图像中的黄色比例尺代表50μm。（h） 半胱天冬酶3+细胞比率的量化。控制：n=12（每个，n=4个字段）；22DS:n=24（每个，n=4个字段）。条形代表平均值±SE**第页 < 0.01. 每个图表示每一行的值。
图2
图2
22q11.2DS iPSC源性多巴胺能神经元中PERK表达和活性下调。（a） 使用多巴胺能神经元对内质网应激传感器及其相关蛋白进行免疫印迹（第24天）。P-PERK：磷酸化PERK；P-eIF2α：磷酸化eIF2 a；P-IRE1：磷酸化IRE1。（b–i）定量PERK/β-actin、P-eIF2α/eIF2α、ATF4/β-acton、GADD34/β-attin、ATF6/β-atton、GRP78/β-aptin、IRE1/β-actorin、P-IRE1/IRE1比值。免疫印迹分别进行了四次（b和d；对照组[n=12]，22DS[n=24]），三次（f和h；对照组[n=9]，22DS[n=18]）或两次（c，e，g和i；对照组（n=6]，22DS[n=12]）。Control1的值已设置为1。每个图表示每一行的值。条形代表平均值±SE*第页<0.05时**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001.
图3
图3
22q11.2DS模型小鼠和iPSCs脑内PERK表达的检测。（a） 成人WT和WT脑片制备示意图删除（3.0Mb）/+老鼠。SN=大量黑。（b–e）使用区域A和区域b进行免疫印迹分析。黄色箭头表示用于定量的部分。b和c：同时检测PERK和TH，以GAPDH为内标。d： PERK和TH的双重检测：SNAP29的表达降低，这是22q11.2缺失区域的因素之一。（f–h）第3节区域A中TH/GAPDH、PERK/GAPDH和PERK/TH比率的量化。f、 g和h分别对应于b、c和d。免疫印迹定量检测由Odyssey完成。免疫印迹分别进行四次（f和g）或六次（h）。条形图中显示的数字代表相对值（WT=100）。条形代表平均值±SE***第页 < 0.001. （i） 使用从iPSC中提取的蛋白质进行PERK、ATF6、IRE1和β-肌动蛋白的免疫印迹。（j） PERK/β-actin、ATF6/β-acton和IRE1/β-attin比值的量化。进行了两项独立实验（总之，对照组：n=6；22DS:n=12）。Control1的值为1。每个图表示每一行的值。条形代表平均值±SE。
图4
图4
PERK缺陷型iPSC的产生。（a） 在有或无沙丁胺醇（Sal）的TCM存在下的细胞存活率。n=24（22DS1_1，n=6；22DS1_ 2，n=6。每个图表示每一行的值。条形代表平均值±SE**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001. （b） 使用22DS组定量caspase 3-阳性（+）细胞比率。含或不含Sal的TCM治疗（0.4μg/ml）。使用了20个字段（每个字段，n=5）。图中表示平均值±标准偏差**第页 < 0.01. （c） 本研究中使用的CRISPR/Cas9系统的靶点。（d） PERK缺陷等基因系的指数模式。（e） 对多巴胺能神经元（第24天）进行TH和βIII-管蛋白免疫染色的代表性图像。比例尺代表50μm。（f） 通过量化第24天TH+与βIII-管蛋白+细胞的比率分析多巴胺能神经元分化效率。条形代表平均值±SE。使用了五个字段。（g） 第24天使用DA神经元对PERK和β-肌动蛋白进行免疫印迹。（h） 测量神经突长度。条形图中显示的数字表示计数的单元格数。条形代表平均值±SE。（i） 内质网应激下的细胞存活率（n=7）。这些图表示平均值±标准偏差***第页 < 0.001, †††第页<0.001与不含TCM的比较。（j） 使用多巴胺能神经元对裂解型半胱氨酸3进行免疫染色的代表性图像。白色箭头表示Caspase3+细胞。图像中的黄色比例尺代表50μm。（k） 切割钙蛋白酶3+细胞比率的量化（n=14）。条形代表平均值±SE*第页 < 0.05, **第页 < 0.01. 每个图表示每条线的值。
图5
图5
F-actin动力学受损和PERK功能障碍。（a） 实验时间的示意图。（b） 第22天，Control1和22DS1_1的代表性图像用阴茎倍体蛋白染色。图像中的黄色比例尺代表50μm。洋红色方框代表丝状伪足。黄色箭头代表lamellipodia。（c） 出现典型跛足的细胞比率。条形图上的数字表示计数的单元格数***第页<0.001。（d） 丝状体长度的测量。条形图中显示的数字表示计数的丝状体数量。条形代表平均值±SE***第页 < 0.001. （e） 自动检测系统的代表性结果。骨骼化区域（上部），除了被检测为细胞体的区域（中部），被识别为丝状突起（下部）。（f） 22DS组在第22天使用或不使用Sal（40μM）用阴茎肽染色的细胞的代表性图像。黄色比例尺代表50μm。（g） 使用自动检测系统测量突起长度。条形图中显示的数字表示已计数字段的数量。每个图表示每一行的值。条形代表平均值±SE***第页 < 0.001. （h） 对照组在第22天用或不用GSK2656157（GSK，0.4μM）或Sal（40μM）染色的生殖激素染色的细胞的代表性图像。黄色比例尺代表50μm。（i） 使用自动检测系统测量突起长度。条形图中显示的数字表示已计数字段的数量。每个图表示每一行的值。条形代表平均值±SE***第页 < 0.001. （j） 药物操作（g和i）对PERK活性的影响总结。对照组的平均长度设为100。（k） 第22天，Control4和KO#4的代表性图像用阴茎肽染色。黄色比例尺代表50μm。（l） 丝状体长度的测量。条形图中显示的数字表示已计数的丝状伪足的数量。条形代表平均值±SE***第页 < 0.001.
图6
图6
全球蛋白质合成和PERK功能障碍。（a） 在第24天对对照组和22DS组的嘌呤霉素和β-肌动蛋白进行免疫印迹。用嘌呤霉素治疗30分钟。（b） a中纯化蛋白信号强度的定量。对照1的值设置为1。进行了两项独立实验（总之，对照组，n=6；22DS，n=8）。每个图表示每一行的值。条形代表平均值±SE**第页 < 0.01. （c） 在第24天，使用22DS组对嘌呤霉素和β-肌动蛋白进行免疫印迹，包括或不包括Sal（40μM）。用嘌呤霉素治疗30分钟。（d） 第24天使用Control4、KO#4和KO#10 DA神经元对嘌呤霉素和β-肌动蛋白进行免疫印迹。用嘌呤霉素治疗30分钟。（e） d中纯化蛋白信号强度的量化。Control4的值设置为1。进行了三个独立的实验。每个图表示每一行的值。条形代表平均值±SE。
图7
图7
22DS和PERK缺乏组的ER-mitochondria接触者。（a） 对Control4和KO#4（第24天）多巴胺能神经元的代表性图像进行钙网蛋白（ER）和TOMM20（线粒体）免疫染色。图像中的黄色比例尺代表10μm。（b） 左面板：使用Mander方法进行的共同定位分析的代表性结果。右侧面板：Mander的共同本地化分析。条形图中显示的数字表示已计数字段的数量。条形代表平均值±SE***第页 < 0.001. （c） 对Control1和22DS1_1（第24天）多巴胺能神经元的代表性图像进行钙网蛋白和TOMM20免疫染色。（d） 左面板：使用Mander方法进行的共同定位分析的代表性结果。图像中的黄色比例尺代表10μm。右侧面板：Mander的共同本地化分析。条形图中显示的数字表示已计数字段的数量。条形图表示平均值±SE***第页 < 0.001.
图8
图8
DGCR14与PERK表达下调有关。（a） DGCR14敲除细胞中DGCR14的相对表达水平***第页 < 0.001. （b） 使用阴性靶细胞和DGCR14敲除细胞进行PERK和β-肌动蛋白免疫印迹。”“阴性靶标”是指使用阴性对照RNAi。（c） PERK/β-肌动蛋白比率的量化。进行了三个独立的实验。条形图表示平均值±SE*第页 < 0.05, **第页 < 0.01. N的值设置为1。（d） 来自健康对照组和22q11.2DS患者的iPSCs和多巴胺能神经元（第24天）中DGCR14 mRNA表达水平的量化。条形代表平均值±SE。多巴胺能神经元中的22DS1_2和22DS2_1：n=4；其他：n=3***第页 < 0.001. （e） DGCR14敲除细胞中嘌呤霉素和β-肌动蛋白的免疫印迹。（f） e中纯化蛋白信号强度的量化。N值设置为1。条形代表平均值±SE。每个n=4**第页 < 0.01, ***第页<0.001 vs N.（g）用放线菌酮（CHX）处理的多巴胺能神经元中嘌呤霉素和β-肌动蛋白的免疫印迹。（h） 使用CHX处理的多巴胺能神经元对βIII-管蛋白进行免疫染色的代表性图像。图像中的黄色条为100μm。（i） 测量神经突长度。条形图中/上方显示的数字表示计数的单元格数。条形代表平均值±SE***第页 < 0.001. （j） 图形摘要。
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