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.2021年1月11日；13（1）：e12798。
doi:10.15252/emm.202012798。 Epub 2020年12月7日。

重组免疫抑制性髓细胞有助于大肠癌的免疫治疗

陆伟强 1, 余伟伟（Weiwei Yu） 1, 何嘉诚 1, 刘文娟 1, 杨俊杰 1, 林显华（Xianhua Lin） 1, 张远进（音） 1, 王欣（Xin Wang） 1, 姜文浩 1, 罗健（Jian Luo） 1, 张千森 1, 杨怀玉 1, 彭世宏 1, 郑方毅 1, 山城人 2, 陈静（音译） 三, 斯特凡·西科 4, 鲁斯·努西诺夫 5 6, 程飞雄 7 8 9, Hankun Zhang（张汉坤） 1, 刘明耀教授 1
附属公司

重组免疫抑制性髓细胞有助于大肠癌的免疫治疗

陆伟强等。 EMBO分子医学. .

摘要

免疫检查点阻断（ICB）对结直肠癌的作用有限，强调了协同靶向互补机制的要求。在这里，我们确定了前列腺素E2（PGE2)受体4（EP4）是免疫抑制性髓细胞（IMC）的主要调节因子，是ICB治疗耐药的主要驱动因素。PGE公司2-结合EP4促进免疫抑制性M2巨噬细胞和髓源性抑制细胞（MDSC）的分化，并减少免疫刺激性M1巨噬细胞的扩张。为了探讨EP4信号的免疫治疗作用，我们开发了一种新型的选择性EP4拮抗剂TP-16。TP-16能有效阻断IMC的功能，增强细胞毒性T细胞介导的体内肿瘤清除。细胞共培养实验表明，TP-16促进了T细胞增殖，而肿瘤衍生CD11b会破坏T细胞增殖+髓细胞。值得注意的是，TP-16和抗PD-1联合治疗显著阻碍肿瘤进展并延长小鼠生存期。我们进一步证明，在IMC相关的自发性结直肠癌小鼠模型中，TP-16提高了抗PD-1治疗的反应性。总之，本研究表明，抑制表达EP4的IMC可能为提高大肠癌免疫治疗的疗效提供了一种潜在的策略。

关键词：大肠癌；免疫抑制性髓细胞；免疫治疗；前列腺素E2受体4。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人声明他们没有利益冲突。

数字

图1
图1。EP4是IMC的主要监管机构

  1. EP亚型在骨髓髓细胞和结肠癌髓细胞中的表达。黑色短线表示单个表达式，蓝色和黄色线表示每个条件下的平均表达式级别。灰色虚线表示Ptger1和Ptger3或Ptger2和Ptger4之间的总体平均值。

  2. EP亚型在CD11b中的表达+磁珠分离法分离CT26荷瘤小鼠肿瘤组织和脾脏细胞(n个 = 3).

  3. 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM‐CSF）/白细胞介素（IL）‐4诱导的小鼠单核细胞DC/巨噬细胞分化试验示意图。用不同EP受体的特异性拮抗剂处理细胞：ONO‐8711，EP1；PF‐04418948，EP2；L‐798106，EP3；以及E7046、EP4。

  4. 显示前列腺素E2（PGE）作用的典型流式细胞术图2)和EP1‐4拮抗剂对小鼠骨髓单核细胞树突状细胞（DC）/巨噬细胞分化的影响(n个 = 3).

  5. F4/80的频率+CD11C公司−巨噬细胞和F4/80−CD11C公司+流式细胞术分析不同处理下的DC(n个 = 3).

  6. GM‐CSF/IL‐6诱导的小鼠骨髓单核细胞髓源性抑制细胞（MDSC）分化分析的示意图(n个 = 3).

  7. 显示前列腺素E作用的典型流式细胞仪图2和EP1‐4拮抗剂对小鼠骨髓衍生MDSC分化的影响。上部副面板：车辆组和PGE2组。下亚板：ONO‐8711（EP1拮抗剂）组、PF‐04418948（EP2拮抗剂）、L‐798106（EP3拮抗剂）和E7046（EP4拮抗剂）。(n个 = 3).

  8. Ly6C的频率+赖氨酸6G−mMDSC和Ly6C中间赖氨酸6G+流式细胞术分析不同处理下的PMN‐MDSC(n个 = 3).

数据信息：数据以平均值±SEM表示。（A） Kolmogorov–Smirnov试验；（E，H）双尾未配对学生t吨进行了试验*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P）<0.001。完全正确P（P）值和统计试验列于附录表S8中。
图2
图2。一种有效且选择性的EP4拮抗剂TP‐16的发现和表征

  1. TP‐16的化学结构。

  2. EP4表达293细胞中GloSensor™cAMP测定中TP‐16的剂量-效应曲线(n个 = 3).

  3. PGE中TP‐16的剂量-效应曲线2诱导钙通量测定(n个 = 3).

  4. 前列腺素E的Schild图2存在不同浓度的TP‐16。TP‐16改变了PGE的剂量-反应曲线2以剂量依赖的方式诱导细胞内cAMP水平(n个 = 3).

  5. pA2Schild图的值和斜率。

  6. TP‐16与人类EP4蛋白假定结合囊中的关键残基对接。EP4显示为彩色卡通，对相互作用重要的残留物显示为品红色棒，TP‐16显示为青色棒图。

  7. LIGPLOT图总结了TP‐16（紫色线）和源自EP4的残基之间的关键相互作用。T69、T76、T168和R316与TP‐16建立氢键。带有辐射线的半圆表示非极性相互作用。

数据信息：数据显示为三个独立实验的平均值±SEM，结果相似。
图EV1
图EV1。TP‐16的拮抗活性、药代动力学特征和安全性
  1. A类

    HEK293细胞中cAMP报告基因检测中TP‐16的剂量反应。数据表示为来自三个独立实验的平均值±SEM(n个 = 3).

  2. B类

    PGE中TP‐16的剂量-效应曲线2β-抑制蛋白Tango测定。数据表示为来自三个独立实验的平均值±SEM(n个 = 3).

  3. C–E类

    通过在CHO细胞中过度表达Gα16蛋白，通过钙通量测定测定TP‐16对EP4的拮抗活性。TP‐16对EP4的剂量-反应曲线：猴子（C）、大鼠（D）和小鼠（E）。数据表示为来自三个独立实验的平均值±SEM(n个 = 3).

  4. F、 G公司

    分别以1 mg/kg和10 mg/kg的剂量静脉和口服TP-16后，TP-16的血浆浓度随时间的变化曲线。结果显示为三只CD1小鼠的平均值±SEM(n个 = 3).

  5. H（H）

    以14天重复剂量口服TP‐16（100 mg/kg/天）的雄性和雌性SD大鼠的体重。数据以平均值±SD表示(n个=3/性别/组）。

数据信息：数据以平均值±SEM表示，H除外。
图3
图3。EP4拮抗剂TP‐16在小鼠同基因肿瘤模型中强烈抑制肿瘤生长

  1. 小鼠同基因肿瘤模型的建立和药物治疗计划的示意图。当肿瘤体积达到100‐200 mm时，建立的肿瘤模型每天用载体或TP‐16口服治疗三.

  2. E7046（150 mg/kg）和TP‐16（37.5、75和150 mg/kg）在CT26荷瘤BALB/c小鼠中的抗肿瘤活性(n个=每组11人）。CT26模型中的肿瘤生长曲线（左侧面板）。条形图显示了与给药前后相比肿瘤生长的个别变化（右侧面板）。肿瘤体积达到100–200 mm三第7天。

  3. 有代表性的图表显示，TP-16的抗肿瘤活性在植入BALB/c裸鼠的CT26肿瘤中消失（左面板）(n个 = 8). 条形图显示了给药前后肿瘤生长的个体变化（右图）。肿瘤体积达到100–200 mm三第7天。

  4. 采用流式细胞仪分析CT26荷瘤BALB/c小鼠肿瘤组织的单细胞悬浮液中免疫细胞的浸润情况。CD8肿瘤内频率的代表性流式细胞术和点图+T细胞(n个 = 5).

  5. C57BL/6小鼠结肠癌（MC38）异种移植瘤治疗18天后的生长曲线（左侧）和相对变化（右侧）(n个=7）。肿瘤体积达到100–200 mm三第7天。

  6. 采用流式细胞术分析MC38荷瘤C57BL/6小鼠肿瘤组织的单细胞悬浮液，用载体或TP‐16治疗2周，以检测免疫细胞浸润。CD8肿瘤内频率的代表性流式细胞术和点图+T细胞(n个 = 5).

  7. 原位结直肠癌小鼠模型CT26‐Luc模型的代表性生物发光图像（左面板）和定量生长曲线（右面板）(n个 = 4).

数据信息：数据以平均值±SEM表示。（B） 单向方差分析（ANOVA），Tukey多重比较检验*P（P） < 0.05. （C‐G）双尾未成对学生t‐进行试验*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01. 完全正确P（P）值和统计试验列于附录表S8中。可在线获取此图的源数据。
图EV2
图EV2。TP‐16抑制EP4对肿瘤生长和肿瘤内免疫细胞亚群的影响
  1. A类

    CT26异种移植瘤在BALB/c小鼠体内的生长曲线。当肿瘤体积达到100-200mm时，用TP‐16（75 mg/kg，p.o.，daily）或塞来昔布（100 mg/kg，p.o.，doily）治疗CT26荷瘤小鼠16天三（第7天）。数据以平均值±SEM表示。单向方差分析（ANOVA），Tukey的多重比较***P（P）<0.001。n个 = 6.

  2. B、 C类

    TP‐16对BALB/c小鼠4T1异种移植瘤和C57BL/6小鼠Pan02异种移植肿瘤的抗肿瘤活性。当肿瘤体积达到100–200 mm时，用TP‐16（75 mg/kg，po，每日）治疗小鼠三（第7天）。数据表示为平均值±SEM。双尾未配对学生的t吨进行了试验**P（P） < 0.01; ***P（P） < 0.001 (n个 = 8).

  3. D、 E类

    通过流式细胞术分析，对CT26荷瘤BALB/c小鼠的肿瘤单细胞悬浮液进行瘤内免疫细胞分析，这些肿瘤悬浮液用载体或75 mg/kg TP‐16治疗2周。CD11b的代表图和量化+80层/四层+巨噬细胞（D）和CD45+CD11b型+CD11c公司+MHC二期+树突状细胞（DC）（E）。数据表示为平均值±SEM。双尾未成对学生的t吨进行了试验*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01 (n个 = 5).

  4. F类

    CD11b中TNF-α的代表性图形和量化+从CT26异种移植瘤中分离的细胞(n个 = 6). 数据表示为平均值±SEM。双尾未成对学生的t吨进行了测试***P（P）<0.001，与车辆控制组相比。

  5. G公司

    CD11b中p‐CREB的代表性免疫荧光图像+CT26肿瘤组织的细胞。比例尺，50μm。

  6. H（H）

    原位结直肠癌小鼠模型CT26‐Luc模型骨髓细胞室的变化(n个 = 4). 双尾未成对学生的t‐进行了测试*P（P） < 0.05, **P（P）与车辆对照组相比，<0.01。

  7. 一、 J型

    CD4+T细胞活化标志物IFN‐γ（H）和TNF‐α（I）的代表性图形和量化(n个=5）。数据以三个独立实验得出的平均值±SEM表示。进行了双尾非配对学生t检验，***P<0.001，与车辆对照组相比。

可在线获取此图的源数据。
图4
图4。EP4拮抗剂TP‐16重组肿瘤相关骨髓细胞（IMC）并增强抗肿瘤免疫
  1. A、 B类

    收集用载体或TP‐16治疗2周的CT26荷瘤BALB/c小鼠的肿瘤，并通过流式细胞术分析肿瘤单细胞悬液中肿瘤相关的髓细胞。F4/80的代表性图形和量化+MHC‐II公司+免疫抑制性髓样细胞（IMC）-M1巨噬细胞（A）和F4/80+2006年+IMC‐M2巨噬细胞（B）对CD45的门控作用+CD11b型+髓样细胞(n个 = 5).

  2. C类

    代表性流式细胞术分析和Ly6C定量+赖氨酸6G‐IMC-单核细胞髓源性抑制细胞（mMDSC）和Ly6C中间赖氨酸6G+IMC‐PMN‐CD45上的MDSC频率选通+CD11b型+髓样细胞(n个 = 5).

  3. D–G型

    CT26肿瘤流式分选M1巨噬细胞（D）、M2巨噬细胞（E）、mMDSC（F）和PMN‐MDSC（G）上所选M1、M2和MDSC标记物的相对表达。数据归一化为β-actin表达水平(n个 = 5).

  4. H–K型

    CD8的代表性流量分析和量化+T细胞活化标记物：Granzyme B（H）、IFN‐γ（I）、TNF‐α（J）和PD‐1（K）(n个 = 5).

数据信息：数据以平均值±SEM表示。（A‐K）双尾未成对学生t吨‐测试*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P）<0.001。完全正确P（P）值和统计试验列于附录表S8中。
图EV3
图EV3
当与肿瘤浸润性CD11b培养时，TP‐16抑制M2巨噬细胞分化并逆转T细胞增殖+髓样细胞
  1. A类

    用M-CSF/IL-4/PGE培养小鼠骨髓细胞2连续6天，同时（第0天）或连续（第3天）添加不同浓度的TP‐16。M2巨噬细胞的生成（F4/80+2006年+)通过流式细胞术分析。Si：同时进行TP‐16治疗；Se：序贯TP‐16治疗。数据表示为平均值±SEM。进行了单因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比较检验***P（P） < 0.001 (n个 = 3).

  2. B、 C类

    用20 ng/ml小鼠重组IL‐4单独或与100 nM PGE联合刺激小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMM）2在指示时间内，在没有或存在10μM TP‐16的情况下。p‐STAT3的表达705，p‐状态3727、p-STAT3、p-AKT473，p‐AKT308Western blotting检测AKT。GAPDH充当装载控制。

  3. D、 E类

    代表性直方图（D）和CD4百分比（E）+以2:1、1:1和1:2 CD4的比率进行T细胞增殖+CD11b的T细胞+用载体或75 mg/kg TP‐16治疗2周后从CT26荷瘤小鼠中收集的髓样细胞。所有数据均表示为来自三个独立实验的平均值±SEM(n个 = 3). 双尾未成对学生的t‐进行了测试***P（P）<0.001。

可在线获取此图的源数据。
图5
图5。EP4拮抗剂TP‐16逆转PGE的免疫抑制作用2髓系分化与活化
  1. A、 B类

    在缺乏或存在PGE的情况下，用50 ng/ml小鼠重组IFN‐γ（A）或20 ng/ml鼠重组IL‐4（B）刺激M‐CSF诱导的小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMM）2±改变TP‐16浓度12小时。所选M1标记的mRNA水平(Cxcl10公司和Tnfa公司)和M2标记(参数‐1和第1年)用qPCR检测。数据归一化为β-actin表达水平(n个 = 3).

  2. C类

    骨髓细胞与40 ng/ml GM‐CSF/IL‐6培养或与PGE共同刺激2±改变TP‐16浓度6天。Ly6C的代表性定量+赖氨酸6G−单核细胞髓源性抑制细胞（mMDSCs）和Ly6C中间赖氨酸6G+PMN‐MDSC(n个 = 3).

  3. 天

    骨髓细胞用GM‐CSF/IL‐6处理6天以诱导MDSC，然后用PGE处理2±改变TP‐16浓度12小时。MDSC标记物的mRNA水平(Arg‐1、Ptgs2、Il‐4、，和伊尔-10)用qPCR检测。数据归一化为β-actin表达水平(n个 = 3).

  4. E、 F类

    CT26肿瘤浸润CD11b的体外T细胞抑制活性+用载体或75 mg/kg TP‐16治疗2周后收集的髓系细胞。CD8（CD8）+用CFSE标记T细胞，然后在没有或存在肿瘤浸润CD11b的情况下用CD3/CD28抗体刺激3天+来自载体或75 mg/kg TP‐16治疗的CT26肿瘤的髓样细胞。增殖性CD8的代表性流式细胞术直方图（E）和百分比（F）+以2:1、1:1和1:2 CD8的比例电镀T细胞+T细胞至CD11b+髓样细胞(n个 = 3).

数据信息：数据以平均值±SEM表示。（A‐D，F）单向方差分析，Tukey的多重比较*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P）<0.001。完全正确P（P）值和统计试验列于附录表S8中。
图6
图6。EP4拮抗剂TP‐16提高CT26荷瘤小鼠的免疫检查点阻断效果并诱导持久的抗肿瘤免疫反应

  1. 使用载体、TP‐16（75 mg/kg，p.o.，每日）、抗-PD‐1抗体（50μg，i.p.，每周两次）或其组合（左）治疗时CT26肿瘤体积的增长以及第0天到第20天（右）之间肿瘤体积的百分比变化(n个 = 12).

  2. 对患有皮下CT26肿瘤的BALB/c小鼠进行载体、TP‐16（75 mg/kg，p.o.，每日）、PD‐1抗体（50μg，i.p.，每周两次）或联合治疗2周。动物存活率（肿瘤负担时间达到2000 mm三)使用GraphPad Prism通过Kaplan–Meier方法进行分析(n个 = 10).P（P）使用对数秩检验计算值。

  3. CT26荷瘤小鼠肿瘤切片的代表性免疫荧光染色图像，CD8和DAPI染色。比例尺，50μm。

  4. 对CT26荷瘤小鼠肿瘤切片进行p-STAT3、p-AKT和PD-L1染色的代表性免疫染色图像。比例尺，100μm。

  5. 使用安捷伦SurePrint G3小鼠GE V2.0微阵列分析TP‐16和抗-PD‐1协同作用介导的转录组剖面变化。维恩图描绘了改变基因的数量（FC≥2或FC≤−2，P（P）≤0.05）。

  6. 用于RNA‐seq分析的T细胞活化生物标记物的热图。热图标度的单位是基因定心和标度后的表达值。

数据信息：数据以平均值±SEM表示。（A） 单向方差分析—单向分析（ANOVA），Tukey的多重比较**P（P） < 0.01; ***P（P）<0.001。（B） 对数秩检验*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P）<0.001。完全正确P（P）值和统计试验列于附录表S8中。可在线获取此图的源数据。
图EV4
图EV4。EP4拮抗剂（TP‐16）联合免疫检查点阻断的体内疗效

  1. 小鼠体重（CT26同基因肿瘤模型）。

  2. 用载体、TP‐16（75 mg/kg，po，每日）、抗-PD‐1（50μg，ip，每周两次）和TP‐6与抗-PD-1抗体联合治疗的MC38肿瘤的生长(n个=每组8个）。数据表示为平均值±SEM。进行了单向方差分析和Tukey多重比较试验*P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01; ***P（P）<0.001。

  3. 小鼠体重（MC38同基因肿瘤模型）。

  4. CT26荷瘤小鼠骨髓来源抑制细胞（MDSCs；CD11b）肿瘤切片的代表性免疫荧光染色图像+第1组+和M2巨噬细胞（CD11b+2006年+，下部面板）。比例尺，50μm。

  5. 在治疗的最后一天，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定CT26荷瘤小鼠外周血中的细胞因子（IL‐6和CXCL1）(n个 = 6). 单向方差分析（ANOVA）和土耳其事后（post-hoc）进行了测试*P（P） < 0.05, **P（P） < 0.01; ***P（P）<0.001。

  6. 根据受TP‐16和抗PD‐1抗体联合治疗影响的差异表达基因子集，分析路径富集。

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图7
图7。TP‐16使抗PD‐1抗体在AOM/DSS诱导的结直肠癌模型中有效
  1. A类

    偶氮甲烷/右旋糖酐硫酸钠（AOM/DSS）诱导的结直肠癌模型和药物治疗方案的建立示意图。AOM/DSS诱导的结直肠癌小鼠接受载体、TP‐16（75 mg/kg，po，每日）、PD‐1抗体（50μg，ip，每周两次）或TP‐6和抗PD‐2联合治疗。终点为治疗开始后第37天。

  2. B–D类

    指定治疗5周后，代表性切除结肠（B）、每只小鼠结肠肿瘤总数（C，左）和肿瘤大小分布（C，右）以及结肠长度（D）(n个 = 7).

  3. E类

    代表性苏木精和伊红（H&E）染色和免疫染色用于载体、TP-16、抗PD-1抗体或TP-16和抗PD-1联合治疗的肿瘤的CD8、p-STAT3、p-AKT和ARG-1。比例尺，500μm（左图像），50μm（右图像）。

  4. F类

    免疫抑制相关基因mRNA水平的定量聚合酶链式反应（qPCR）分析(n个 = 6).

数据信息：数据以平均值±SEM表示。（C，左面板）单向方差分析（ANOVA），Tukey的多重比较**P（P） < 0.01; ***P（P）<0.001。（C，右面板）双尾未成对学生t吨‐测试*P（P）<0.05**P（P） < 0.01; ***P（P）<0.001。（F） 完全正确P（P）值和统计试验列于附录表S8中。可在线获取此图的源数据。
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