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.2021年4月;20(4):548-559.
doi:10.1038/s41563-020-00849-5。 Epub 2020年11月30日。

肿瘤相关巨噬细胞驱动基质细胞依赖性胶原交联和硬化,促进乳腺癌侵袭

附属公司

肿瘤相关巨噬细胞驱动基质细胞依赖性胶原交联和硬化,促进乳腺癌侵袭

奥里·马勒等。 自然材质. 2021年4月.

摘要

基质硬化伴随恶性肿瘤,影响治疗并促进肿瘤侵袭。阐明肿瘤中调节基质硬化的分子性质和因素应确定生物标记物,将患者分层进行治疗和干预,以改善结果。我们分析了赖氨酰羟化酶介导和赖氨酰氧化酶介导的胶原交联,并量化了基质最硬的侵袭性人类乳腺癌亚型中总胶原交联和复杂胶原交联的最大丰度。这些组织中含有最多的肿瘤相关巨噬细胞,这些巨噬细胞在实验模型中的治疗性消融减少了转移,减少了胶原交联和基质硬化。交联酶赖氨酰氧化酶的上皮靶向表达对PyMT乳腺肿瘤中的胶原交联无影响,而基质细胞靶向表达则有影响。显微解剖的人类肿瘤中的基质细胞表达最高水平的胶原蛋白交联酶。一组乳腺癌患者活检的免疫组织化学分析显示,赖氨酸羟化酶2的基质表达与疾病特异性死亡率显著相关,赖氨酰羟化酶是一种诱导羟赖氨酸醛衍生胶原交联和基质硬化的酶。这些发现将组织炎症、基质细胞介导的胶原交联和硬化与肿瘤侵袭联系起来,并将赖氨酸羟化酶2确定为基质生物标记物。

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数字

扩展数据图1:
扩展数据图1:。MS的部分分配2交联氨基酸标准品的裂解光谱。
微软2部分MS赋值的市售交联氨基酸标准的裂解光谱2裂解光谱(LNL、DHLNL和dPyr)。前体离子的质子化形式用MH表示+标签。碎片离子上方的彩色圆圈与全光谱上方建议的碎片离子结构相匹配,或在空间允许的情况下列在离子上方。
扩展数据图2:
扩展数据图2:。优化的交联氨基酸分析(xAAA)能够准确测量各种组织类型的胶原蛋白状态。
()xAAA工作流程示意图。临床标本通过固相萃取(SPE)进行水解和浓缩。(b条)在混合四极轨道仪上用LC-SRM分析富集水解液。微软2光谱用于准确识别交联氨基酸(xAAs),例如二羟基赖氨酸钠(DHLNL)(c(c))显示组织胶原蛋白和(d日)在人类乳房、肺、皮肤、骨骼、气管和肌腱中测量的总xAA(汇总n个=每个组织3个)。将计算的氨基酸交联丰度归一化为组织总胶原蛋白含量(即羟脯氨酸丰度),该含量根据干组织重量计算。最终值已绘制为基于峰面积的相对丰度。条形图描绘了赖氨酸衍生的胶原交联(LCC)和羟基赖氨酸衍生的胶原交联(HLCC)物种的相对丰度。
扩展数据图3:
扩展数据图3:。LOX介导的交联的丰度与患者年龄无关。
()散点图按亚型显示正常(n=4)和肿瘤组织(ER+n=8,HER2+n=6,TN n=5)样本患者年龄的平均值和SEM。(b-f型)散点图显示了在正常和肿瘤乳腺组织中测量的每种LCC和HLCC交联水平与患者年龄的关系。交联的总丰度()通过求和所有单个交联和总组织HLCC丰度计算(小时)通过对DHLNL、Pyr和d-Pyr求和计算得出。将所有交联值归一化为总胶原蛋白含量(即羟脯氨酸丰度)和干组织重量,并绘制为对数2从LC-MS数据转换归一化峰面积。最佳拟合线及其斜率和r2值显示在每个绘图上。所有n值代表生物独立的人体组织样本。
扩展数据图4:
扩展数据图4:。强力霉素(DOX)治疗的MMTV-rtTA中LOX过度表达的验证+/−TetO_mLox公司+/−老鼠。
(a至c)流式细胞术分析小鼠乳腺上皮细胞中GFP表达的代表性点图(n=2)。GFP和mLOX编码在同一mRNA转录本上,具有独立的翻译起始位点。()在DOX处理的MMTV-rtTA中诱导GFP表达+/−TetO_mLox公司+/−老鼠。(b至c)缺少MMTV-rtTA启动子的对照小鼠中未诱导GFP表达(b条)或未接受DOX治疗的对照小鼠(c(c)). 为了选择乳腺上皮细胞,筛选出抗小鼠CD45-APC、抗小鼠CD31-APC、抗小鼠Ter119APC抗体阳性的细胞。(d日)RT-qPCR定量控制MMTV-rtTA小鼠乳腺Lox基因表达−/−TetO_mLox公司+/−小鼠(n=2)和Lox过度表达MMTV-rtTA+/−TetO_mLox公司+/−(n=2)只小鼠。(e(电子))来自对照(n=4)和上皮LOX过表达(n=6)PyMT肿瘤的全肿瘤裂解物的蛋白质印迹。用平均值±SEM的散射图量化标准化E-cadherin每条带的光学密度。对这些裂解产物进行一次Western blot。使用双尾Mann-Whitney U检验Pro-LOX**p=0.0095,Claved LOX*p=0.0381进行统计分析。所有n值代表生物学上独立的小鼠组织样本。
扩展数据图5:
扩展数据图5:。诱导型赖氨酰氧化酶表达的设计体内在MMTV-PyMT模型的背景下使用TetOFF系统。
()PCR结果和N端和C端PCR引物的序列,以确认TetO_mLox转基因掺入。(b条)感应式TetOFF系统图。TetO_mLox转基因分别在强力霉素存在或不存在时可逆地关闭或打开。
扩展数据图6:
扩展数据图6:。PyMT胶原蛋白交联丰度在8周和11周肿瘤之间没有增加。
(a-f型)显示总胶原交联水平的单个值和平均值±SEM的散点图(),总HLCC(b条)、LNL(c(c)),HLNL(d日)、DHLNL(e(电子)),和Pyr((f))8周(n=10)和11周龄(n=9)PyMT肿瘤。将交联归一化为总胶原蛋白含量(即羟脯氨酸丰度)和干组织重量,计算每个组织的交联量。数值绘制为对数2根据LC-MS数据量化转换归一化峰面积。使用双尾非配对t检验进行统计分析()p=0.6149(b条)p=0.7451(c(c))p=0.7235(d日)p=0.1766(e(电子))p=0.7563((f))p=0.4687。所有n值代表生物学上独立的小鼠肿瘤标本。
扩展数据图7:
扩展数据图7:。早期纤维化前巨噬细胞表达M2a标记物,并在抗CSF1治疗后丢失。
()散点图显示8周龄小鼠经IgG1治疗(n=6)或抗CSF1治疗(n=4)的PyMT肿瘤中每个视野F4-80阳性细胞数量的个体值和平均值±SEM。(b至c)散点图显示表达标记物MHCII和CD86的F4/80阳性细胞百分比的单个值和平均值±SEM(b条)和标记物CD163和Relmα(c(c))在8周龄小鼠的IgG1治疗(n=6)或抗CSF1治疗(n=4-5)PyMT肿瘤中。(d-g型)散点图显示了其他非巨噬细胞免疫人群CD11b每个视野(FOV)的细胞数的单个值和平均值±SEM+F4-80层(d日)、MHCII你好F4-80层(e(电子)),CD45+CD4细胞+((f))和CD45+CD8(CD8)+()在IgG1中(n=4e、 克n=5d、 (f))和抗CSF1(n=6)治疗小鼠。统计分析(a-g公司)采用双尾Mann-Whitney U检验()*p=0.019(b条)MHCII公司你好p=0.7190,CD86+p=0.4286(c(c))CD163型+*p=0.0303,Relmα+p=0.0381(d日)p=0.9719(e(电子))p=0.1524((f))p=0.3074()p=1.000。(小时)从8周和11周PyMT肿瘤中筛选的巨噬细胞差异表达基因的热图。()8周龄IgG1治疗和抗CSF1治疗的PyMT小鼠的代表性图像,细胞角蛋白8/18(绿色)、PDGFRα(洋红色)、波形蛋白(黄色)和DAPI(蓝色)染色。比例尺为100μm。(j个)散点图显示成纤维细胞(波形蛋白)的平均±SEM+和PDGFRα+)8周龄IgG1治疗(n=6)和抗CSF1(n=5)治疗PyMT小鼠的每个视野。所有n代表(a-j型)值表示生物学上独立的小鼠组织标本。(k米)描述CD163基因表达与LOX的Spearman相关性的散点图(k个),PLOD2()和LOXL2(*p=0.0143)()在人类乳腺肿瘤中(n=1904个生物学上独立的人类组织标本)。
扩展数据图8:
扩展数据图8:。单个试样的ECM刚度。
()散点图显示了被归类为正常乳腺组织(黑圈)或浸润性导管癌(IDC;红色方块)的个体人体样本的原子力显微镜(AFM)显微压痕测量的平均值和个体值。(b条)散点图显示多西环素治疗的MMTV-PyMT小鼠乳腺肿瘤的AFM显微压痕测量的平均值和个体值+/−列1a1-tTA+/−TetO-mLox对照小鼠(DOX-ind PyMT Con;黑圈)或基质Lox过度表达的水处理小鼠(water PyMT Lox OX;红色方块)。(c(c))散点图显示了来自8周龄IgG1治疗的(IgG对照;红色方块)和抗CSF1治疗的(aCSF1-Ab;黑色圆圈)PyMT肿瘤的单个小鼠乳腺肿瘤的AFM显微压痕测量的平均值和个体值。
扩展数据图9:
扩展数据图9:。PLOD2与无远处转移生存率和无复发生存率的相关性。
()显示按雌激素和表皮生长因子受体2(ER/HER2)状态分层的患者中相对PLOD2基因表达水平的Log2标度数据图(ER+HER2−n=314;ER−或+/HER2+n=73;ER−/HER2−n=133). 晶须表示最小值和最大值,方框表示25第个和75第个百分位数和中位数。使用Kruskal-Wallis单因素方差分析(***p<0.0001)和双尾Mann-Whitney U检验进行统计分析,比较各亚型之间的PLOD2表达水平,无需对个体比较的多重比较进行调整(***p<000001)。(b条)显示雌激素受体阳性和表皮生长因子受体两种阴性乳腺肿瘤(ER+/-HER2−;低n=157,高n=157). (c(c))雌激素受体阴性或阴性以及表皮生长因子受体两种阳性乳腺肿瘤(ER−或+/HER2+;低n=36&高=37). (d日)雌激素受体阴性表皮生长因子受体阴性乳腺肿瘤患者的DMFS线形图(ER−HER2−;低n=66,高=67). 进行统计分析,比较每种亚型或Log-rank(Mantel-Cox)检验的PLOD2和DMFS(b条)p=0.8051(c(c))*p=0.0144(d日)p=**0.0050。(电子-克)Kaplan-Meier曲线表明在ER+/PR+中评估的无复发生存概率(e(电子)),HER2+((f)),和三重负极()乳腺癌患者确诊后16年内。PLOD2(LH2基因编码)表达与RFS之间的相关性已使用在线工具确定(http://kmplot.com/analysis/)如方法中所述。顶部和底部面板表示来自同一数据库的两个不同Affymetrix PLOD2探针(202619和202620)。对于Kaplan-Meier曲线,使用LogRank检验进行统计分析。
扩展数据图10:
扩展数据图10:。乳腺癌中LOX和肿瘤上皮LH2表达的评估。
()Biomax BC081116c TMA的肿瘤上皮LOX染色由研究人员用强度评分进行评估,并分层为阴性/低、中或高。(b条)Biomax BC081116c TMA的基质LOX染色由研究人员用强度评分进行评估,并分为阴性/低、中等或高。比例尺为500μm。(c(c))收集乳腺癌发病病例的肿瘤样本,构建组织芯片(TMA),包括每个肿瘤的两个1mm核心。病理学家用半定量强度评分对肿瘤上皮LH2染色进行评估,并将其分层为阴性、低或中/高。比例尺为500μm。患者信息见补充表2。(d日)肿瘤上皮LH2强度评分与肿瘤分级的临床相关性。(e(电子))Kaplan-Meier曲线表明乳腺癌患者在诊断后10年内根据上皮LH2强度评估的累积乳腺癌特异生存率(BCSS)(LH2阴性n=271,弱n=112,中/高n=77)。((f))上皮LH2强度的BCSS曲线仅包括腋窝淋巴结阴性患者(LH2阴性n=175,弱n=67,中/高n=50)。()上皮LH2强度的BCSS曲线仅包括腋窝淋巴结阳性患者(LH2阴性n=84,弱n=42,中/高n=26)。对于肿瘤分级和LH2强度评分,采用线性关联进行统计分析(***p<0.001)。对于Kaplan-Meier曲线,统计分析采用LogRank检验(e(电子))*p=0.025((f))*p=0.038()p=0.165。
图1:
图1:。羟脯氨酸-胶原交联丰度与人类乳腺癌侵袭性相关
()正常乳腺组织(n=4)和浸润性肿瘤的代表性图像,诊断为ER+肿瘤(n=8)、HER2+肿瘤(n=6)和TN肿瘤(n=6)。苏木精和伊红染色的人类乳腺组织的Brightfield图像(H&E)。苦味酸红(PS)的偏振光图像用嵌入的亮场图像染色人类乳腺组织。人类乳腺组织的双光子二次谐波(SHG)图像显示胶原组织(绿松石色)和碘化丙啶(PI;红色)染色细胞核。比例尺,100μm。(b条)AFM显微压痕法测量正常乳腺组织(n=10)和浸润性乳腺癌(IBC;n=10。使用双尾Mann-Whitney U检验进行统计分析(****p<0.0001)。(c(c))正常乳腺组织(n=4)和IBC组织(n=19)中总胶原交联的平均值±SEM散点图。使用双尾Mann-Whitney U检验进行统计分析(**p=0.0016)。(d-j型)散点图显示了正常乳腺组织(n=4)、ER+(n=8)、HER2+(n=6)和TN(n=6)乳腺肿瘤中测得的每个交联、总丰度和总HLCC水平的单个和平均值±SEM。使用单向方差分析检验对交联进行统计分析,并使用不调整多重比较的双尾非配对t检验进行个体比较。(d日)总体**p=0.0051,正常TN*p=0.0228,ER+-TN*p=0.0116,HER2+-TN p=0.0612。(e(电子))总体**p=0.0039,正常-ER+*p=0.0187,正常-HER2+**p=0.0083,正常-TN**p=0.0054,ER+-TN**p=0.0027,HER2+-TN*p=0.0114。((f))总体***p=0.0003,正常-ER+**p=0.0041,正常-HER2+***p=0.0002,正常-TN**p=0.0014,ER+-TN*p=0.0475,HER2+-TN p=0.06。()总体**p=0.002,正常-TN*p=0.016,ER+-TN**p=0.0043,HER2+-TN*p=0.0191。(小时)总体**p=0.003,正常-TN*p=0.0212,ER+-TN**p=0.0019,HER2+-TN*p=0.0186。()总体***p=0.0001,正常-ER+*p=0.0329,正常-HER2+*p=0.0315,正常-TN**p=0.0049,ER+-TN**p=0.0019),HER2+-TN**p=0.0057。(j个)总体***p=0.0002,正常ER+*p=0.028,正常HER2+**p=0.0083,正常TN**p=0.0053,ER+-TN**p=0.0032),HER2+-TN**p=0.0072。(k、 我)Spearman相关系数热图显示了总胶原蛋白交联水平和I型胶原蛋白含量之间的相关性(k个)以及每个HLCC的水平和弹性模量测量的前10%之间()按肿瘤亚型分层。所有n值代表生物独立的人体组织样本。
图2:
图2:。LOX和PLOD2在TNBC中富集,主要由基质细胞表达。
(a至c)LOX的基因表达分析(),LOXL2(b条)和PLOD2(c(c))按ER分层+(n=1355),HER2+(n=127)和三阴性(TN;n=299)亚型。基因表达用平均值±SEM绘制为mRNA z评分的散点图。使用单向方差分析进行统计分析,并使用不调整多重比较的双尾非配对t检验进行个体比较。()总体***p<0.0001,ER+-HER2+***p=0.0001,ER+-TN***p<0.0001,HER2+-TN****p=0.0008。(b条)总体p=0.7984,ER+-HER2+p=0.5435,ER+-TN p=0.7198,HER2+-TN p=0.7505。(c(c))总体***p<0.0001,ER+-HER2+**p=0.01,ER+-TN***p<0.0001,HER2+-TN****p<0.0001。(d日)个体值和平均值±SEM散点图,比较人类浸润性乳腺癌显微切割上皮和基质分区中LOX(n=47)和PLOD2(n=57)基因的表达。使用双尾Mann-Whitney U检验****p<0.0001进行统计分析。(e(电子))LOX和PLOD2基因表达倍数变化的个体和平均值±SEM散点图(d日)基质细胞相对于上皮细胞。(f-g(胎龄))基质/上皮基因表达分析的限制(d日)和(e(电子))雌激素受体(ER)阴性和孕激素受体(PR)阴性样本。(LOX n=11,PLOD2 n=15)。使用双尾Mann-Whitney U检验进行统计分析**p=0.002,*p=0.0204。(小时)条形图显示了按分子亚型分层的人类患者肿瘤中上皮LOX染色强度的分布。()条形图显示按分子亚型分层的人类患者肿瘤间质LOX染色强度的分布。研究人员对Biomax BC081116c TMA进行了LOX评分(ER+n=43,HER2+n=38,TN n=18上皮,19基质)。(j个)条形图显示了按分子亚型分层的人类患者肿瘤中上皮LH2染色强度的分布。(k个)条形图显示了按分子亚型分层的人类患者肿瘤间质LH2 H评分的分布。病理学家对来自MDCS队列的患者样本进行LH2评分。患者信息见补充表2和3。所有n值代表生物独立的人体组织样本。
图3:
图3:。上皮衍生胶原蛋白交联酶不能诱导胶原蛋白交联。
()描述用于诱导上皮Lox过度表达的实验策略的示意图。(b条)偏振光图像,带有黑刺鼠红色染色的小鼠乳腺组织的亮场插图。比例尺为100μm。(c(c))散点图显示PyMT对照组(水n=4,DOX n=3)和PyMT上皮Lox过度表达组(n=6)每个视野的苦苷红染色面积百分比的平均±SEM。使用Kruskal-Wallis单因素方差分析*p=0.010和双尾Mann-Whitney U检验进行统计分析,未对个体比较的多重比较进行调整**p=0.0095,*p=0.0238。(d日)散点图显示了PyMT对照组(水n=4,DOX n=4)和PyMT上皮Lox过度表达(n=8)中总组织胶原交联的个体和平均值±SEM。(电子-小时)散点图显示了在PyMT对照组(水n=4,DOX n=4)和PyMT上皮Lox过度表达(n=8)肿瘤组织中测得的每个LCC和HLCC胶原交联的单个和平均值±SEM。()散点图显示总HLCC的单个值和平均值±SEM。使用单向方差分析进行总体比较和非配对t检验,对交联数据进行统计分析,而不对单个比较的多重比较进行调整。(d日)总体p=0.8077。(e(电子))总体p=0.899。((f))总体p=0.4286。()总体p=0.4586。(小时)总体p=0.2128。()总体p=0.4325。所有n值代表生物学上独立的小鼠组织样本。
图4:
图4:。基质衍生LOX调节胶原蛋白交联和硬化。
()描述实验策略的示意图。(b条)正常小鼠乳腺(n=4)和PyMT对照(n=3)和基质Lox过度表达(PyMT-Lox OX;n=4 on)肿瘤的代表性图像,带有H&E染色的亮场图像,带有苦味酸红(PS)染色亮场嵌入的偏振光图像,二次谐波(SHG)图像(绿松石)和碘化丙啶(PI;红色)染色细胞核和共焦图像第397页FAK染色(红色)和DAPI(蓝色;细胞核)。比例尺为100μm。(c(c))正常乳腺(n=5)、PyMT对照(n=3)和PyMT Lox OX(n=4)的平均值±SEM苦味酸红染色的单个值散点图(按每个视野的面积百分比)。使用普通单因素方差分析**p=0.0034对总体关系和双尾非配对t检验进行统计分析,未对单个组的多重比较进行调整**p=0.03*p=0.018。(d日)散点图显示了PyMT Control(n=3)与PyMT Lox OX(n=4)在乳腺基质上进行的AFM显微压痕测量的前10%弹性模量的单个值和平均值。使用双尾Mann-Whitney U检验进行统计分析(****p<0.0001)。(e(电子))柱状图显示了AFM测量的前10%弹性模量在PyMT对照和Lox OX肿瘤中的分布。使用双尾Mann-Whitney U检验进行统计分析(****p<0.0001)。((f))散点图显示正常乳腺(n=4)中总胶原蛋白交联丰度的个体值和平均值±SEM,与多西环素治疗的PyMT对照肿瘤(n=3)和PyMT-Lox-OX肿瘤(n=四)的腺体相比。(g-j公司)散点图显示了正常乳腺(n=4)、PyMT对照肿瘤(n=3)和PyMT Lox OX肿瘤(n=四)中LCC和HLCC交联的单个和平均值±SEM。(k个)散点图显示正常乳腺(n=4)、PyMT对照肿瘤(n=3)和PyMT Lox OX肿瘤(n=四)中总HLCC的个体和平均值±SEM。使用单向方差分析进行总体比较,使用双尾非配对t检验进行交联数据的统计分析,而不调整单个比较的多重比较。((f))总体***p<0.0001,正常对照**p=0.0019,正常箱OX***p<0.0001,控制箱OX*p=0.0236。()总体*p<0.0125,正常-箱OX**p=0.0027,控制-箱OX*p=0.0494。(小时)总体***p<0.0001,正常对照***p<0.0019,正常Lox OX***p<0.0001。()总体***p<0.0001,正常对照***p=0.0001,正常箱OX***p<0.0001,控制箱OX*p=0.0473。(j个)总体**p=0.0025,正常对照**p=0.005,正常箱OX*p=0.0356,控制箱OX*p=0.0318。(k个)总体***p<0.0001,正常对照***p=0.0005,正常Lox OX***p<0.0001,对照Lox OX*p=0.0251。所有n值代表生物学上独立的小鼠组织样本。
图5:
图5:。肿瘤浸润巨噬细胞分泌TGFb激活基质介导的胶原交联。
()用抗CSF1阻断抗体或IgG1对照治疗的8周龄小鼠PyMT肿瘤的代表性图像。IgG1处理的(n=6)和抗CSF1处理的(n=5)PyMT肿瘤的泛细胞角蛋白(绿色)、F4/80(白色)和DAPI(蓝色)染色。用苦味酸红(PS)染色的IgG1治疗(n=6)和抗CSF1治疗(n=6)PyMT肿瘤的亮场嵌入偏振光图像。IgG1治疗(n=6)和抗CSF1治疗(n=5)的PyMT肿瘤染色第397页FAK(红色)和DAPI(蓝色)。比例尺为100μm。(b条)通过PyMT IHC对11周龄IgG1治疗(n=5)和抗CSF1治疗(n=6)小鼠肺组织中转移集落的散点图,显示单个值和平均±SEM。使用双尾非配对t检验进行统计分析*p=0.0363。(c(c))用抗CSF1阻断抗体(n=6)或IgG1对照(n=5)治疗的8周龄小鼠的PS染色散点图,显示单个值和平均值±SEM(按每视野面积百分比)。使用双尾非配对t检验p=0.08进行统计分析。(d日)PyMT IgG1治疗(n=7)和抗CSF1治疗(n=5)肿瘤中AFM显微压痕法测量弹性模量前10%的直方图。使用双尾Mann-Whitney U检验****p<0.0001进行统计分析。(e(电子))IgG1治疗(n=6)和抗CSF1治疗(n=5)PyMT肿瘤和DAPI(蓝色)中Lox和Plod2 mRNA原位杂交的代表性图像。比例尺均为100μm。(f-g(胎龄))基质Lox的单个值和平均值±SEM的散点图((f))或基质柱2()mRNA原位杂交在8周龄用抗CSF1(n=5)或IgG1对照(n=6)治疗的小鼠中的平均基质强度。使用双尾Mann-Whitney U检验进行统计分析((f))*p=0.0381和()*p=0.0303。(小时)散点图显示了IgG1(n=6)和抗CSF1(n=5)治疗小鼠肿瘤中总羟脯氨酸(胶原蛋白含量)的个体和平均值±SEM。(i-n号)显示总胶原交联水平的单个值和平均值±SEM的散点图()、LNL(j个),HLNL(k个)、DHLNL(),梨()和总HLCCS(n个)8周龄IgG1治疗组(n=9i、 k、l、n或10j、 米)抗CSF1(n=11)治疗PyMT肿瘤。计算每个组织的交联量,将交联归一化为干组织重量。根据LC-MS数据量化的标准化峰面积绘制值。统计分析(氢-氮)采用双尾非配对t检验(小时)*p=0.0447()*p=0.0174(j个)*p=0.0359(k个)*p=0.0235()*p=0.0311(n个)*p=0.0366。(o(o))通过RT-qPCR在肿瘤细胞、癌相关成纤维细胞和PyMT肿瘤中分离的巨噬细胞(n=4)中Tgfb1基因表达的单个值和平均值±SEM散点图。使用Kruskal-Wallis单因素方差分析进行总体比较,使用双尾Mann-Whitney U检验进行个体比较。总体***p=0.0002,肿瘤CAF*p=0.0286,肿瘤TAM*p=0.086,CAF-TAM*p=0.0286。(第页)用IgG1(n=6)和抗CSF1(n=5)治疗的小鼠PyMT肿瘤的代表性图像,泛细胞角蛋白(绿色)染色,第465/467页SMAD2(红色)和DAPI(蓝色)。比例尺为100μm。(q个)散点图显示基质平均核强度的单个值和平均值±SEM第465/467页IgG1治疗(n=6)和抗CSF1治疗(n=5)PyMT小鼠的SMAD2。采用双尾非配对t检验进行统计分析(p=0.06)。对于(a-q型)所有n值代表生物学上独立的小鼠组织标本。(第页)人类乳腺肿瘤系列切片的代表性IHC图像第465/467页SMAD2和CD68,并用苏木精复染。比例尺为100μm。()基质线性回归相关散点图第465/467页人类乳腺肿瘤中SMAD2 IHC染色与基质CD68 IHC着色(n=10,*p=0.0248)。(t吨)描述CD14线性回归的散点图+CD11b型+人类白细胞抗原-DR+肿瘤相关巨噬细胞(流式细胞仪检测为%CD45+),其平均弹性模量由AFM显微压痕法在人类乳腺肿瘤中测量(n=15,**p=0.0025)。对于(r-t型)所有n值代表生物独立的人体组织样本。
图6:
图6:。基质LH2预测患者预后较差。
(a-b公司)Kaplan-Meier图显示了基于上皮细胞LOX表达的患者总体生存率(低n=28,高n=36)()或基质细胞(低n=23,高n=24)(b条). (c-d公司)Kaplan-Meier图显示了基于上皮细胞中PLOD2表达的患者总体生存率(低n=28,高n=29)(c(c))或基质细胞(低n=23,高n=24)(d日). 对于(a至d)中位表达被定义为低表达和高表达的分界点。(e(电子))人类乳腺癌组织微阵列(TMA)的典型相位对比图像。切片经IHC用H&E和赖氨酰羟化酶2(LH2)染色。((f))显示基质LH2 H评分和肿瘤分级之间临床相关性的条形图(患者人数见补充表3)。病理学家用0到300的半定量基质特异性H评分评估LH2 IHC染色。LH2 H评分的最低三分位数定义为H评分在0到120之间,中度H评分在120到230之间,基质LH2评分最高在230以上。对于肿瘤分级和LH2 H评分,采用线性关联进行统计分析(*****p<0.0001)。()Kaplan-Meier曲线表明乳腺癌患者在诊断后10年内根据基质LH2 H评分评估的累积乳腺癌特异生存率(BCSS)(LH2低n=175,中n=188,高n=146)。(小时)基质LH2 H评分的BCSS曲线仅包括腋窝淋巴结阴性患者(LH2低n=116,中n=116、高n=90)。()基质LH2 H评分的BCSS曲线仅包括腋窝淋巴结阳性患者(LH2低n=44,中n=63,高n=54)。对于Kaplan-Meier曲线,通过LogRank检验进行统计分析()**p=0.008()*p=0.026。所有n值代表生物独立的人体组织样本。

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