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.2021年1月25日；41（2）：e00445-20。
doi:10.1128/MCB.00445-20。 2021年1月25日打印。

环状RNA 100146通过MicroRNA 149/HMGA2轴促进结直肠癌进展

刘坤鹏 1, 牟玉华 1, 石秀芳 2, 刘廷坤 3, 陈占峰 1, 左兴美 4
附属公司

环状RNA 100146通过MicroRNA 149/HMGA2轴促进结直肠癌进展

刘坤鹏等。 分子细胞生物学. .

摘要

结直肠癌（CRC）已发展成为全球第三大癌症相关死亡原因。研究证实，环状RNA（circRNAs）吸收microRNAs（miRNAs，miRNA）来调节下游基因的功能。本研究旨在探讨circRNA 100146在大肠癌中的作用机制。采用实时定量PCR（RT-qPCR）检测circRNA 100146、miRNA 149（miR-149）和高迁移率组AT-Hook 2（HMGA2）的表达。使用甲基噻唑四氮唑（MTT）、流式细胞术和跨阱分析评估了一系列生物功能效应（细胞存活、凋亡、迁移/侵袭）。蛋白质水平通过Western blot分析测定。建立异种移植模型体内实验。通过双核糖核酸酶报告试验、RNA免疫沉淀试验或RNA下拉试验评估circRNA 100146、miR-149和HMGA2之间的相互作用。circRNA 100146在大肠癌组织和细胞中上调。circRNA 100146敲除抑制细胞增殖，促进凋亡，抑制迁移和侵袭在体外阻碍肿瘤生长体内此外，miR-149受circRNA 100146负调控，靶向HMGA2并介导其表达。此外，miR-149干扰消除了沉默的circRNA 100146在增殖、凋亡、迁移和侵袭中的活性。此外，HMGA2的过度表达减弱了上述由circRNA 100146沉默引起的效应，而HMGA2 3'非翻译区（3'-UTR）miR-149结合位点的突变导致其丧失这种能力。circRNA 100146通过靶向miR-149/HMGA2轴，抑制SW620和SW480细胞的增殖，增强凋亡，并阻止迁移和侵袭。

关键词：HMGA2；circRNA 100146；大肠癌；miR-149。

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数字

图1
图1
circRNA 100146在大肠癌组织和细胞中上调。（A） 根据GEO数据库（登录号：。GSE126094标准和GPL19978标准). （B） 通过RT-qPCR检测CircRNA100146在CRC组织和邻近正常组织中的表达。（C） 采用RT-qPCR方法检测转移阳性和阴性患者中circRNA 100146的表达。（D） 采用RT-qPCR方法检测I+II、III和IV期患者中circRNA 100146的表达。（E）采用RT-q PCR方法检测SW620、SW480、HCT116、LOVO细胞和正常结肠上皮细胞系NCM460中circRNA100146的表达。在SW620（F）和SW480（G）细胞中，用RNase R或不使用RNase R-消化RNA后，进行（F和G）RT-qPCR分析。对转染sh-NC、sh-circRNA 100146 no.1或sh-cirrRNA 1001462 no.2的SW620（H）和SW480（I）细胞进行（H和I）RT-qPCR分析，P（P） < 0.05之间。
图2
图2
circRNA 100146敲低阻碍CRC细胞生长在体外用MTT法检测转染sh-NC或sh-circRNA 100146 no.1的SW620和SW480细胞的细胞活力。外径，光密度。（C） 流式细胞术检测转染SW620和SW480细胞的凋亡情况。（D和E）用转染法评估转染SW620和SW480细胞的迁移和侵袭。（F和G）Western blot分析检测转染SW620（F）和SW480（G）细胞中PCNA、Bcl-2、E-cad和MMP9的蛋白水平，P（P） < 0.05之间。
图3
图3
circRNA 100146与miR-149结合并负调控miR-149。（A和B）RT-qPCR检测circRNA 100146、U6和18S rRNA在细胞质和细胞核中的表达。（C） 显示了miR-149中circRNA 100146的潜在野生型和突变结合位点。在与miR-NC或miR-149和WT-circRNA 100146或MUT-circRNA100146共转染的SW620（D）和SW480（E）细胞中进行（D和E）双荧光素酶报告子分析。（F和G）RIP分析用于测量SW620（F）和SW480（G）细胞中circRNA 100146和miR-149的富集水平。（H和I）分别用WT或MUT circRNA 100146转录将生物素化miR-147或miR-NC转染到SW620（H）和SW480（I）细胞。捕获链霉亲和素后，用qRT-PCR检测circRNA 100146的表达水平。（J） 通过RT-qPCR检测转染sh-NC或sh-circRNA 100146 no.1的SW620和SW480细胞中miR-149的表达。（K） 采用RT-qPCR检测miR-149在大肠癌组织和邻近正常组织中的表达。（L） miR-149在正常结肠上皮NCM460和CRC细胞系（SW620和SW480）中的表达。（M） 通过Pearson分析确定circRNA 100146表达和miR-149表达之间的相关性。*，P（P） < 0.05之间。
图4
图4
miR-149逆转了circRNA 100146对CRC细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。（A和B）用MTT法检测转染sh-NC、sh-circRNA 100146 no.1、sh-NC加抗miR-149或sh-cirrRNA 1001461 no.1加抗miR 149的SW620（A）和SW480（B）细胞的存活率。（C） 流式细胞术检测转染SW620和SW480细胞的凋亡情况。（D和E）转染的SW620（D）和SW480（E）细胞的迁移和侵袭通过跨阱分析进行评估。（F和G）进行蛋白质印迹分析以检测转染的SW620（F）和SW480（G）细胞中蛋白质（PCNA、Bcl-2、E-cad和MMP9）的表达。*，P（P） < 0.05之间。
图5
图5
miR-149靶向HMGA2并调节其表达。（A） 显示了miR-149中HMGA2的具有野生型或突变结合位点的推定序列。在HMGA2 3′-UTR-WT和HMGA2 2 3′-UTR-MUT组中，对转染miR-NC或miR-149的SW620（B）和SW480（C）细胞进行（B和C）双荧光素酶报告分析。（D和E）分别用RT-qPCR和Western blot检测转染miR-NC、miR-149、sh-NC、sh-circRNA 100146 no.1或sh-cirrRNA 1001461 no.1加抗miR-149.的SW620和SW480细胞中HMGA2的mRNA（D）和蛋白（E）水平。（F和G）分别用RT-qPCR和Western blot检测大肠癌组织和癌旁正常组织中HMGA2的mRNA（F）和蛋白（G）水平。（H和I）分别用RT-qPCR和Western blot检测结肠上皮NCM460和CRC细胞系（SW620和SW480）中HMGA2的mRNA（H）和蛋白（I）水平。（J） 通过Pearson分析确定miR-149表达与HMGA2表达之间的相关性。（K） 通过Pearson分析确定circRNA 100146和HMGA2表达之间的相关性。*，P（P） < 0.05之间。
图6
图6
circRNA 100146敲除通过调节HMGA2表达抑制细胞生长。用sh-NC、sh-circRNA 100146 no.1、sh-NC加Lv-HMGA2或sh-cirrRNA 1001461 no.1加Lv-MMGA2转染SW620和SW480细胞。（A和B）转染SW620和SW480细胞后检测HMGA2的mRNA（A）和蛋白（B）水平。采用（C和D）MTT法检测转染SW620（C）和SW480（D）细胞的细胞活力。（E） 流式细胞术检测转染SW620和SW480细胞的凋亡情况。（F和G）转染SW620（F）和SW480（G）细胞后，用转染法检测细胞的迁移和侵袭。通过Western blot检测转染SW620（H）和SW480（I）细胞中PCNA、Bcl-2、E-cad和MMP9的（H和I）蛋白水平，P（P） < 0.05之间。
图7
图7
sh-circRNA 100146通过miR-149/HMGA2轴限制CRC进展体内将带有circRNA 100146稳定敲除的SW620细胞注射到裸鼠体内。28日 接种后第天，小鼠被杀死。（A至C）测量肿瘤体积（A），分离的组织用于拍照（B）和测量（C）。（D和E）对于转移实验，对显示的肺转移结节进行拍照（D）和计数（E）。（F和G）RT-qPCR检测circRNA 100146（F）和miR-149（G）的表达。（H） Western blot检测HMGA2、PCNA、Bcl-2、E-cad和MMP9的蛋白表达，P（P） < 0.05之间。
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