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.2020年10月22日：26:100335。
doi:10.1016/j.jbo.2020.100335。 eCollection 2021年2月。

ELF1激活的FOXD3-AS1通过吸收miR-296-5p上调ZCCHC3促进骨肉瘤细胞的迁移、侵袭和EMT

王磊（Lei Wang） 1
附属公司

ELF1激活的FOXD3-AS1通过海绵miR-296-5p上调ZCCHC3促进骨肉瘤细胞的迁移、侵袭和EMT

王磊（Lei Wang）. 骨癌杂志. .

摘要

骨肉瘤是一种常见于青少年的恶性肿瘤。长非编码RNA（lncRNAs）在癌症中的关键作用日益引起人们的关注。然而，FOXD3反义RNA 1（FOXD3-AS1）在OS中的具体功能尚不清楚。在本研究中，FOXD3-AS1在OS标本和细胞系中表现出增强的水平，其缺陷抑制了OS中的细胞迁移、侵袭和上皮-间充质转化（EMT）。然后，我们证实了FOXD3-AS1与microRNA-296-5p（miR-296-5p）的相互作用，以及miR-296-5p的过度表达阻断了OS细胞的迁移、侵袭和EMT。此外，miR-296-5p靶向含锌指CCHC型3（ZCCHC3），FOXD3-AS1通过螯合miR-296-5p释放ZCCHC3。此外，拯救实验表明，ZCCHC3上调可中和FOXD3-AS1缺失对OS体外行为和体内肿瘤发生的抑制作用。此外，E74样ETS转录因子1（ELF1）刺激FOXD3-AS1转录，并且ELF1沉默抑制的OS细胞恶性表型被FOXD3-AS1上调所抵消。总的来说，本研究阐明了ELF1激活的FOXD3-AS1通过吸收miR-296-5p增加ZCCHC3的表达，加剧了OS的细胞迁移、侵袭和EMT，这可能为研究人员寻找OS治疗的有效靶点提供潜在的指导。

关键词：ELF1；FOXD3-AS1；骨肉瘤；ZCCHC3；miR-296-5p。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所报道的工作。

数字

图1
图1
FOXD3-AS1下调抑制OS中的细胞迁移、侵袭和EMT。（A） 通过RT-qPCR检测FOXD3-AS1在52个OS组织和匹配的非肿瘤组织中的表达。学生的t吨测试。（B） RT-qPCR检测了OS细胞系与正常OB3细胞中FOXD3-AS1的表达。单向方差分析。（C） 通过RT-qPCR分析FOXD3-AS1基因敲除的效率。单向方差分析。（D） 创伤愈合试验（比例尺=200μm）显示了MG-63和HOS细胞在FOXD3-AS1敲除下的迁移能力。单向方差分析。（E） Transwell分析（比例尺=200μm）检测转染MG-63和HOS细胞的侵袭性。单向方差分析。（F） Western blot检测转染MG-63和HOS细胞中E-cadherin和N-cadherin的蛋白水平。（G） IF分析（比例尺=50μm）评估转染MG-63和HOS细胞中E-cadherin和N-cadherin的荧光强度。单向方差分析。**P<0.01。
图2
图2
FOXD3-AS1海绵miR-296-5p在OS中。（A） 亚细胞分馏分析测定FOXD3-AS1在OS细胞中的分布。（B） 通过starBase预测了10种可能与FOXD3-AS1结合的miRNA。（C） RT-qPCR检测转染pcDNA3.1/FOXD3-AS1或pcDNA3.1后FOXD3-ASP1的表达。（D） 荧光素酶报告子分析测量了FOXD3-AS1过度表达对覆盖上述10个miRNAs的报告子荧光素酶活性的影响。（E） RT-qPCR检测了52份OS样本和匹配的非肿瘤对照组中miR-296-5p的表达。（F） 用starBase预测miR-296-5p与FOXD3-AS1的结合序列。（G） RT-qPCR检测了转染NC模拟物或miR-296-5p模拟物的OS细胞中miR-296-5p的表达。（H） 采用荧光素酶报告法测定不同组FOXD3-AS1-WT或FOXD3-AS1-Mut的荧光素素酶活性。以上数据均通过Student’st吨测试*P<0.05，**P<0.01。
图3
图3
miR-296-5p的过度表达阻碍了OS细胞的迁移、侵袭和EMT。（A） 通过伤口愈合试验（比例尺=200μm）监测MG-63和HOS细胞在miR-296-5p升高或不升高的情况下的迁移。（B） Transwell分析（比例尺=200μm）测试了所示MG-63和HOS细胞的侵袭性。（C） Western blot检测了不同转染后MG-63和HOS细胞中E-cadherin和E-cadherin蛋白的水平。GAPDH是装载控制。（D） IF分析（比例尺=50μm）评估了指示MG-63和HOS细胞中E-cadherin和N-cadherin的荧光强度。这些结果都是通过Student’st吨测试*P<0.05，**P<0.01。
图4
图4
FOXD3-AS1通过吸收miR-296-5p增强OS中ZCCHC3的表达。（A） 通过starBase中的PITA、TargetScan、PicTar、microT和RNA22程序筛选出ZCCHC3为miR-296-5p的靶基因。（B） 通过RT-qPCR检测52例OS组织和配对非肿瘤组织中ZCCHC3的表达。学生的t吨测试。（C） RT-qPCR检测ZCCHC3在OB3细胞和OS细胞中的表达。单向方差分析。（D） RT-qPCR检测转染NC抑制剂或miR-296-5p抑制剂后MG-63和HOS细胞中miR-296-5p的表达。学生的t吨测试。（E） RT-qPCR和western blot分析测定了不同组ZCCHC3的mRNA和蛋白水平。单向方差分析。（F） starBase预测了miR-296-5p与ZCCHC3的结合位点。（G） 采用荧光素酶报告法测定不同组ZCCHC3 3′UTR-WT和ZCCHC3'UTR-Mut的荧光素素酶活性。学生的t吨测试。（H） RIP分析检测到FOXD3-AS1、miR-296-5p和ZCCHC3在抗Ago2和抗IgG组中的相对富集。学生的t吨测试。**P<0.01。
图5
图5
FOXD3-AS1通过靶向ZCCHC3在操作系统中发挥作用。（A） RT-qPCR检测转染pcDNA3.1或pcDNA3.1/ZCCHC3后MG-63细胞中ZCCHC_3的表达。学生的t吨测试。（B） 创伤愈合试验（比例尺=200μm）测量了MG-63细胞在不同条件下的迁移。单向方差分析。（C） Transwell分析（比例尺=200μm）测试了不同转染的MG-63细胞的侵袭性。单向方差分析。（D） Western blot检测显示MG-63细胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白水平。（E） IF分析（比例尺=50μm）估计了指示MG-63细胞中E-cadherin和N-cadherin的荧光强度。单向方差分析。**P<0.01。
图6
图6
FOXD3-AS1通过ZCCHC3介导的方式参与OS肿瘤的发生。（A） 肿瘤的代表性图像和生长曲线来源于显示的MG-63细胞。双向方差分析。（B-C）处死小鼠后检测肿瘤体积和重量。单向方差分析。（D） 不同组肿瘤中Ki67、PCNA、E-cadherin和N-cadherin的IHC分析。比例尺=20μm。**P<0.01。
图7
图7
ELF1激活OS中的FOXD3-AS1转录。（A） RT-qPCR分析了ELF1过度表达的效率（Student’st吨试验）和敲除（单向方差分析）。（B） RT-qPCR检测ELF1上调或下调时OS细胞中FOXD3-AS1的表达。学生的t吨测试。（C） JASPAR ELF1的DNA基序。（D） JASPAR预测了FOXD3-AS1启动子中ELF1的两个结合位点。（E） 荧光素酶报告子分析测定了转染pcDNA3.1/ELF1或pcDNA3.1后MG-63和HOS细胞中指示的FOXD3-AS1启动子的荧光素酶活性。学生的t吨测试。（F） ChIP分析验证了这两个OS细胞中ELF1和FOXD3-AS1启动子之间的结合。学生的t吨测试。（G-H）伤口愈合（比例尺=200μm）和跨孔分析（比例杆=200μm）测量了所示MG-63细胞的迁移和侵袭。单向方差分析。（一） Western blot分析显示MG-63细胞中E-cadherin和N-cadherin的蛋白水平。（J） IF分析（标尺=50μm）测定了不同转染条件下MG-63细胞中E-cadherin和N-cadherin的荧光强度。单向方差分析。**P<0.01。
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