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.2020年10月23日：10:552099。
doi:10.3389/fonc.2020.552099。 电子采集2020。

甲基化介导的MicroRNA-497沉默通过上调黏蛋白1促进乳腺癌进展

双涛 1, 李红 2, 马秀珍 2, 彬连（Bin Lian） 2, 何嘉乐 三, 高雅丽 三, 李金平 2
附属机构

甲基化介导的MicroRNA-497沉默通过上调黏蛋白1促进乳腺癌进展

双涛等。 前Oncol. .

摘要

背景：microRNA-497（miR-497）在包括乳腺癌在内的各种恶性肿瘤中具有潜在的抗肿瘤作用。然而，对于miR-497及其可能的靶向mucin（MUC1）在乳腺癌中的作用知之甚少。本研究探讨了miR-497如何以依赖MUC1的方式调节乳腺癌的进展。

方法：检测miR-497和MUC1在乳腺癌组织和细胞中的表达。甲基化特异性聚合酶链反应用于测量miR-497启动子CpG岛的甲基化状态，而染色质免疫沉淀法用于检测甲基转移酶向miR-497启动子区域的募集。通过改变miR-497（过表达）和MUC1（上调和下调）的表达来检测它们在乳腺癌生物学中的作用在体外和体内通过生物信息学数据库和双荧光素酶报告基因分析研究miR-497和MUC1之间的结合亲和力。

结果：乳腺癌组织和细胞系中MiR-497表达下调，MUC1表达上调。此外，甲基化诱导乳腺癌中miR-497的下调。生物信息学分析和双荧光素酶报告基因分析表明，miR-497靶向MUC1。miR-497的过度表达通过下调MUC1抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭，促进乳腺癌细胞凋亡。证实miR-497对肿瘤生长的抑制作用体内试验。

结论：总之，miR-497下调了MUC1的表达，随后抑制了乳腺癌的进展，突出表明miR-496是乳腺癌治疗的潜在生物标记物和治疗靶点。

关键词：DNA甲基化；MicroRNA-497；细胞凋亡；乳腺癌；迁移；黏蛋白1；增殖。

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数字

图1
图1
甲基化诱导乳腺癌中miR-497下调。（A）用RT-qPCR检测miR-497在乳腺癌组织和邻近正常组织中的表达(n个= 68), *第页与正常邻近组织相比<0.05。（B）方法用引物预测miR-497启动子上游CpG岛的存在。（C）MSP用于测量乳腺癌组织和邻近正常组织中启动子甲基化状态。（D）RT-qPCR检测miR-497在乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞中的表达*第页与MCF-10A细胞株相比<0.05#第页与MDA-MB-453、MDA-MB-668和MDA-MB-231细胞系相比，<0.05。（E）MSP用于检测乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞中启动子甲基化状态。（F）miR-497在经或不经5-aza-dc处理的MCF-7中的相对表达*第页与DMSO相比<0.05。（G）ChIP分析用于测量DNMT1/DNMT3（a/b）对miR-497启动子区的富集*第页与DMSO相比<0.05。测量数据表示为平均值±标准偏差。两组之间的数据通过非配对分析t吨-测试，癌症组织和邻近组织之间的数据通过配对进行分析t吨-测试。采用单因素方差分析对多组数据进行分析，然后采用Tukey’s事后（post-hoc）测试。细胞实验独立重复三次。
图2
图2
上调的miR-497抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭并促进凋亡。（A）通过RT-qPCR转染miR-497模拟物24小时后，乳腺癌细胞中证实miR-496过度表达。（B）使用EdU掺入法测量miR-497模拟物转染36 h后乳腺癌细胞的增殖。（C）用western blot分析检测miR-497模拟物转染48小时后MCF-7细胞中Ki67和PCNA的表达，并将其归一化为GAPDH。（D）转染miR-497模拟物24小时后，用Transwell侵袭试验检测MCF-7细胞的侵袭。（E）流式细胞术证实miR-497模拟物转染48 h后MCF-7细胞凋亡。（F）使用蛋白质印迹分析测量转染miR-497模拟物48小时后MCF-7细胞中Bax、总胱天蛋白酶3和裂解的胱天蛋白酶3的表达，其标准化为GAPDH*第页与转染mimic-NC的细胞相比<0.05。测量数据用平均值±标准偏差表示，两组之间的数据用非配对分析t吨-测试。细胞实验独立重复三次。
图3
图3
在乳腺癌细胞中，miR-497可以靶向MUC1并下调其表达。（A）MUC1的预测miR-497结合位点。（B）采用双荧光素酶报告基因分析确认miR-497与MUC1 3′-UTR之间的结合。（C）用Western blot分析检测miR-497模拟物转染48小时后乳腺癌细胞中MUC1的表达，MUC1归一化为GAPDH*第页与转染mimic-NC的细胞相比<0.05。测量数据用平均值±标准偏差表示，两组之间的数据用非配对分析t吨-测试。细胞实验独立重复三次。
图4
图4
MUC1在乳腺癌组织中高表达。（A）western blot分析检测乳腺癌组织及癌旁正常组织中MUC1与GAPDH的相对表达(n个= 68).（B）western blot分析测定乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞中MUC1的相对表达归一化为GAPDH。（C）MUC1在乳腺癌组织和正常癌旁组织中的表达(n个=68）通过RT-qPCR以及MUC1表达与miR-497表达的Pearson相关性测定*第页与正常邻近组织或MCF-10A细胞相比<0.05#第页与MDA-MB-453、MDA-MB-668和MDA-MB-231细胞相比，<0.05。测量数据表示为平均值±标准差，癌组织与邻近组织之间的数据通过配对进行分析t吨-测试。采用单因素方差分析对多组数据进行分析，然后采用Tukey’s事后（post-hoc）测试。细胞实验独立重复三次。
图5
图5
上调的miR-497通过下调MUC1抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭，并促进其凋亡。（A）通过RT-qPCR检测转染24 h后MCF-7细胞中miR-497的表达。（B）使用蛋白质印迹分析测量转染48小时后MCF-7细胞中归一化为GAPDH的MUC1的表达。（C）用EdU掺入法检测转染36 h后MCF-7细胞的增殖。（D）用Western blot分析检测转染48 h后MCF-7细胞中Ki67和PCNA的表达，并将其归一化为GAPDH。（E）用Transwell侵袭试验测定转染24 h后MCF-7细胞的侵袭力。（F）流式细胞术证实MCF-7细胞转染48 h后出现凋亡。（G）用western blot分析检测转染48 h后MCF-7细胞中凋亡相关因子Bax和切割型caspase 3的表达，并将其归一化为GAPDH*第页与sh-NC转染细胞相比<0.05#第页与miR-497模拟物+oe-NC共转染细胞相比，差异<0.05。测量数据用平均值±标准偏差表示，两组之间的数据用非配对分析t吨-测试。细胞实验独立重复三次。
图6
图6
上调的miR-497抑制乳腺癌生长体内通过下调MUC1表达。（A）每组裸鼠肿瘤的代表性图像。（B）各组裸鼠肿瘤生长曲线。（C）各组裸鼠肿瘤重量*第页与sh-NC治疗的小鼠相比，<0.05#第页与用agomir-NC治疗的小鼠相比<0.05n个= 10. 测量数据表示为平均值±标准偏差，两组之间的数据通过非配对分析t吨-测试。通过重复测量ANOVA比较多组在不同时间点的数据，然后是Tukey’s事后（post-hoc）测试。
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