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.2021年1月；23(1):1-11.
doi:10.1016/j.neo.2020.10.13。 Epub 2020年11月13日。

CBP介导的Wnt3a/β-catenin信号通路促进Piwil2启动的宫颈癌发生

丁庆峰 1, 严克勤 1, 梁海燕 1, 景亮 1, 王文辉 2, 欢雨 1, 瀛洲 三, 赵卫东 4, 董忠军 5, 彬玲（Bin Ling） 6
附属机构

CBP介导的Wnt3a/β-catenin信号通路促进Piwil2启动的宫颈癌发生

丁庆峰等。 肿瘤形成. 2021年1月.

摘要

我们之前的研究表明，人乳头瘤病毒癌蛋白E6和E7激活的Piwil2可能会将体细胞重新编程为肿瘤起始细胞（TICs），从而导致宫颈肿瘤病变。维持TICs的干细胞对于宫颈病变的进展至关重要。在此，我们确定，在转染有表达Piwil2慢病毒的HaCaT细胞和低度鳞状上皮内病变、高度鳞状上皮间病变和浸润性癌的宫颈病变标本中，典型Wnt信号异常激活。用ICG-001阻断β-catenin和CREB结合蛋白的相互作用可显著下调重编程因子c-Myc、Nanog、Oct4、Sox2和Klf4，从而导致细胞分化，并防止Piwil2-过表达HaCaT细胞的致瘤性。同样，Piwil2也对宫颈癌中典型的Wnt信号通路进行了严格调控。我们进一步证明，ICG-001提高了顺铂敏感性，显著抑制了宫颈癌单独或与顺铂联合体内外的肿瘤生长。Piwil2激活的β-连环蛋白/CREB结合蛋白介导的转录对TICs的维持至关重要，因此有助于宫颈癌的发生。

关键词：CBP；宫颈癌；Piwil2型；肿瘤起始细胞；Wnt信号。

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数字

图1
图1
Piwil2重组HaCaT细胞和宫颈病变中Wnt/β-catenin信号激活。（A） GSEA图显示干细胞基因集显著富集，热图显示与过度表达Piwil2的HaCaT细胞中细胞重编程相关的基因列表。（B） GSEA证明Piwil2表达与Wnt/β-catenin信号通路激活呈正相关。（C）实时PCR分析HaCaT和HaCaT-Piwil2细胞中Wnt1、Wnt2和Wnt3a mRNA的表达。（D和E）细胞质和细胞核中Wnt3a、TCF和β-catenin的免疫印迹。（F） 代表性切片显示正常宫颈、LSIL、HSIL和宫颈癌标本中Wnt3a、β-catenin和CBP的免疫组化染色。（G） Wnt3a、β-catenin和CBP的免疫反应评分。数据表示为平均值±SD*P（P）<0.05和**P（P）<0.01（按学生）t吨测试。
图2
图2
阻断β-catenin/CBP相互作用可诱导HaCaT-Piwil2细胞分化。（A） 用含有Piwil2的慢病毒转染HaCaT细胞，并用ICG-001或IQ-1处理，每天评估细胞活力。（B和C）用20 µM ICG-001或IQ-1。（D） 用20 µM ICG-001或IQ-1。（E和F）通过实时PCR和免疫印迹法测定经20 µM ICG-001或IQ-1 24小时。数据表示为平均值±SD*P（P）<0.05和**P（P）<0.01（按学生）t吨测试。
图3
图3
ICG-001抑制HaCaT-Piwil2细胞的肿瘤发生体内试验。总共5个 × 106将HaCaT-Piwil2或HaCaT-Lenti细胞皮下注射到裸鼠中。在肿瘤可触及后，小鼠接受腹膜内注射300 mg/kg ICG-001或IQ-1，每周两次，持续4周。每组使用五只小鼠。（A） 治疗4周后，小鼠携带肿瘤和切除肿瘤的典型图像。（B） 每周两次用卡尺测量肿瘤体积。（C） 实验结束时，在牺牲后测量肿瘤重量。（D） 每周测量两次小鼠的体重。数据表示为平均值±SD*P（P）<0.05和**P（P）<0.01（按学生）t吨测试。
图4
图4
CBP/β-catenin促进Piwil2维持干细胞重编程。（A） GSEA图显示HaCaT-Piwil2细胞中Wnt/β-catenin信号激活模块显著富集。（B） 20℃处理后HaCaT-Piwil2细胞β-catenin转位到细胞核的免疫印迹 µM ICG-001或IQ-1 24小时。（C） 用20 微米ICG-001，20 μM IQ-1或DMSO与β-catenin抗血清共同免疫沉淀，并免疫印迹CBP和p300。（D和E）Piwil2的表达和“重编程”因子c-Myc、Nanog、10月4日、Sox2、和Klf4公司通过实时PCR和免疫印迹法在用20 微米ICG-001，20 µM IQ-1或DMSO 24小时。（F） 用20 微米ICG-001，20 µM IQ-1或DMSO 24小时。数据表示为平均值±SD*P（P）<0.05和**P（P）<0.01（按学生）t吨测试。
图5
图5
阻断β-catenin/CBP相互作用可降低宫颈癌细胞的细胞活力、耐药性和多潜能转录因子的表达。（A） 通过实时PCR检测Piwil2过度表达或敲除的宫颈癌细胞系中Wnt3a和β-catenin的表达。（B） 在Piwil2过度表达或敲除的宫颈癌细胞系中，分别对细胞质和细胞核中的Wnt3a和β-catenin进行免疫印迹。（C和D）用20 微米ICG-001，20 µM IQ-1或5 单独使用µg/mL顺铂，20 µM ICG-001和5 µg/mL顺铂联合用药，或20 µM IQ-1和5 μg/mL顺铂联合用药，每天评估细胞活力。（E和F）在Piwil2过度表达或不过度表达的宫颈癌细胞系中，ICG-001或IQ-1存在时顺铂的LD50剂量。G公司多能性转录因子的表达c-Myc、Nanog、10月4日、Sox2、和Klf4公司通过实时PCR在用20 µM ICG-001或20 24小时的µM IQ-1。数据表示为平均值±SD*P（P）<0.05和**P（P）<0.01（按学生）t吨测试。
图6
图6
阻断Wnt/β-catenin抑制宫颈癌异种移植瘤生长体内.雌性裸鼠皮下注射5 × 106HeLa细胞。在可触及肿瘤后，小鼠接受腹腔注射ICG-001（300 mg/kg），IQ-1（300 mg/kg）或DDP（2 mg/kg），ICG-001和DDP联合使用或IQ-1和DDP组合使用，每周两次，持续4周。（A） 治疗4周后，小鼠携带肿瘤和切除肿瘤的典型图像。（B） 每周两次用卡尺测量肿瘤体积。（C） 每周测量两次小鼠的体重。（D） 实验结束时，在牺牲后测量肿瘤重量。数据表示为平均值±SD*P（P）<0.05和**P（P）<0.01（按学生）t吨测试。
图7
图7
提出的Wnt/β-catenin信号传导模型用于维持Piwil2重组的TICs在宫颈癌发生中的表达。Piwil2通过上调“重编程”因子，同时激活Wnt/β-catenin信号，将宫颈上皮重编程为TICs。β-catenin/CBP介导的“重编程”因子转录对于维持TICs和化疗耐药性以及促进宫颈癌的发生至关重要。
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