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.2021年2月1日；320（2）：H630-H641。
doi:10.1152/ajpheart.00389.2020。 Epub 2020年11月8日。

过氧亚硝酸盐分解催化剂增强离体脑线粒体的呼吸功能

亚伦·L·阿尔伯克 1 2, 湿婆S V P Sakamuri 1, 杰瑞德·斯珀林 1, 卫斯理·R·埃文斯 1 2, 拉哈里·科利 1, Venkata N当然 1, 里卡多·莫斯坦尼 1 2, Prasad V G Katakam公司 1 2 三
附属公司

过氧亚硝酸盐分解催化剂增强离体脑线粒体的呼吸功能

亚伦·L·阿尔伯克等。 美国生理学杂志心脏循环生理学. .

摘要

过氧亚硝酸盐（PN）是由一氧化氮（NO）和超氧化物反应产生的，与缺血性和神经变性脑损伤的发病机制有关。线粒体通过线粒体NO合成酶产生NO，通过电子传递链产生超氧物。我们的目的是检测线粒体源性PN的生成并表征其对线粒体呼吸功能的影响。用外源性PN（0.1、1、5µmol/L）或PN供体（SIN-1；50µmol/L）或PN清除剂（FeTMPyP；2.5µmog/L）处理C57Bl/6（野生型，WT）和内皮型NO合成酶敲除（eNOS-KO）小鼠新鲜分离的脑非突触体线粒体。使用安捷伦海马XFe24分析仪测量耗氧率（OCR），计算线粒体呼吸参数。线粒体膜电位、超氧化物和PN分别由罗丹明123、二氢乙硫磷和DAX-J2 PON绿色荧光测量值测定。Western blots检测线粒体蛋白硝基酪氨酸化。外源性PN和SIN-1均降低了WT分离的脑线粒体的呼吸功能。FeTMPyP增强了WT和eNOS-KO线粒体的III态和IV态线粒体呼吸。FeTMP也提高了eNOS-KO线粒体的IIIu态呼吸。与PN不同，SIN-1和FeTMPy均未使线粒体去极化。虽然线粒体蛋白硝基酪氨酸化不受SIN-1或FeTMPyP的影响，但FeTMPy降低了线粒体PN水平。FeTMPyP可增加线粒体超氧化物水平，但PN或SIN-1对其无影响。因此，我们提出了在分离的脑线粒体中产生具有功能意义的PN的证据。线粒体PN活性在WT小鼠中具有生理相关性，在eNOS缺乏的情况下具有病理意义。新的和值得注意的线粒体产生超氧物和一氧化氮，这些物质可能相互作用产生PN。我们在分离的脑和心脏线粒体中观察到eNOS和nNOS免疫反应，发现nNOS的药理抑制作用可以调节线粒体呼吸功能。这项研究提供了证据，证明在生理条件下，分离的脑线粒体中会产生影响呼吸功能的重要PN。重要的是，eNOS缺乏小鼠的线粒体PN水平和活性被夸大，表明其具有病理学意义。

关键词：eNOS；线粒体一氧化氮合酶；nNOS；硝基酪氨酸化；耗氧率。

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数字

图1。
图1。
过亚硝酸根（PN；5 µmol/L）损害线粒体呼吸和线粒体膜电位。A类：基础或II级呼吸。B类：状态III呼吸（ADP诱导）。C类：状态IVo呼吸（寡粘菌素被抑制）。D类：状态IIIu[羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）诱导]。E类：膜电位。使用安捷伦海马XFe24分析仪测量线粒体呼吸参数和线粒体膜电位（ψ米)使用罗丹明123染料进行荧光测量。数据以平均值±SE表示，并通过单因素方差分析进行分析*P（P）<0.05，具有统计学意义。n个 = 5-6只小鼠用于海马实验和n个 = ψ的8只老鼠米研究。
图2。
图2。
SIN-1-1（50 µmol/L）降低分离的脑线粒体的线粒体呼吸。A类：耗氧率（OCR）与时间图。B类基础或状态II呼吸。C类：状态III呼吸（ADP诱导）。D类：状态IVo呼吸（寡粘菌素被抑制）。E类：状态IIIu[羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）诱导]。线粒体分离自野生型（WT；n个 = 5只小鼠）和内皮一氧化氮合酶敲除（eNOS-KO）小鼠(n个 = 6只小鼠）大脑，用SIN-1（50 µmol/L），并使用安捷伦海马XFe24分析仪测量呼吸参数。数据以平均值±SE表示，并通过重复测量的双向方差分析进行分析（数据对某些参数进行了对数转换）*P（P）<0.05和**P（P）<0.01，具有统计学意义。
图3。
图3。
FeTMPyP（2.5 µmol/L）增加分离的脑线粒体的呼吸。A类：耗氧率（OCR）与时间图。B类：基础或II级呼吸。C类：状态III呼吸（ADP诱导）。D类：状态IVo呼吸（寡粘菌素被抑制）。E类：状态IIIu[羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）诱导]。线粒体分离自野生型（WT；n个 = 5只小鼠）和内皮一氧化氮合酶敲除（eNOS-KO）小鼠(n个 = 5只小鼠）大脑，用FeTMPyP（2.5 µmol/L），并使用安捷伦海马XFe24分析仪测量呼吸参数。数据以平均值±SE表示，并通过重复测量的双向方差分析进行分析（数据对某些参数进行了对数转换）*P（P）<0.05，具有统计学意义。
图4。
图4。
过氧亚硝酸盐（PN）供体（SIN-1）和PN清除剂（FeTMPyP）对线粒体膜电位均无显著影响。A类：SIN-1。B类：FeTMPyP。从野生型（WT）和内皮型一氧化氮合酶敲除（eNOS-KO）小鼠中分离出线粒体(n个 = 6只小鼠用于SIN-1和n个 = 用SIN-1（50 µmol/L）或FeTMPyP（2.5 µmol/L）和线粒体膜电位（ψ米)使用罗丹明123染料进行荧光测量。数据以平均值±SE表示，并通过重复测量的双向方差分析进行分析。的值P（P）<0.05被认为具有统计学意义。
图5。
图5。
SIN-1（50 µmol/L）对线粒体蛋白质的硝基酪氨酸化没有显著影响。A类：硝基酪氨酸含量和VDAC（负载控制）的代表性Western blot。B类：代表性条形图。从野生型（WT）和内皮型一氧化氮合酶敲除（eNOS-KO）小鼠中分离出线粒体(n个 = 8–11只小鼠）大脑，用SIN-1（50 µmol/L）。用NP 40缓冲液溶解线粒体颗粒，并进行SDS-PAGE（4%–20%梯度）。用增强化学发光法在免疫斑点上检测蛋白质中的硝基酪氨酸含量。使用ImageJ测量总带强度。数据以平均值±SE表示，并通过重复测量的双向方差分析进行分析。
图6。
图6。
FeTMPyP（2.5 µmol/L）对线粒体蛋白质的硝基酪氨酸化没有显著影响，但会降低过氧亚硝酸盐（PN）的生成。A类：硝基酪氨酸含量和VDAC（负载控制）的代表性Western blot。B类：代表性条形图。C类：线粒体PN生成。从野生型WT和内皮一氧化氮合酶敲除（eNOS-KO）小鼠中分离出线粒体(n个 = 西式4只老鼠，n个 = 4-8只用于PN测量的小鼠）大脑，用FeTMPyP（2.5 μmol/L）持续60分钟。用NP 40缓冲液溶解线粒体颗粒，并进行SDS-PAGE（4%–20%梯度）。用增强化学发光法在抗硝基酪氨酸免疫斑点上检测蛋白质中的硝基酪氨酸含量。使用ImageJ测量总带强度。使用DAX-J2 PON绿色（激发：490）进行PN测量 nm和发射：530 nm）数据以平均值±SE表示，并通过重复测量的双向方差分析进行分析*P（P）<0.05，具有统计学意义。C、 控制；S、 FeTMPyP公司。
图7。
图7。
FeTMPyP增加了分离的脑线粒体中的活性氧（ROS）水平。线粒体是从野生型（WT）小鼠脑中分离出来的，并与过氧亚硝酸盐（PN）（5 µmol/L），SIN-1（50 µmol/L）和FeTMPyP（2.5 µmol/L）30分钟（对于ROS，n个=8–10只小鼠）。使用二氢乙硫酸氢钠（激发：510）测量ROS水平 nm和发射：600 纳米）。数据以平均值±SE表示，并通过单向方差分析进行分析*P（P）≤0.05，具有统计学意义。
图8。
图8。
分离脑线粒体中过氧亚硝酸盐（PN）生成及其对线粒体功能的活性示意图。当超氧物与一氧化氮（NO）反应时，会生成PN。在分离的线粒体中，超氧物来自电子传递链。线粒体产生NO的主要机制有两种。首先，线粒体NOS（mtNOS）已被证明产生NO（38，39）。第二，线粒体中的亚硝化蛋白可能通过反硝化酶的作用释放NO，如线粒体硫氧还蛋白系统（41，42）。线粒体蛋白亚硝化反过来可能由线粒体局部产生的NO或由eNOS（内皮源）和扩散至线粒体膜的nNOS（神经元源）在线粒体外产生的NO诱导。SIN-1和外源性PN为研究PN对线粒体呼吸的影响提供了PN。相反，FeTMPyP清除PN并阻止其对线粒体功能的活性。外源性和内源性PN都抑制线粒体呼吸功能的各个方面。值得注意的是，FeTMPyP增加了分离线粒体的线粒体呼吸功能，表明线粒体中存在PN的内在和生理生成。
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