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.2021年6月；112(6):2272-2286.
doi:10.1111/cas.14713。 Epub 2021年5月2日。

单核苷酸多态性rs4142441和MYC共同调制的长非编码RNA OSER1-AS1通过隔离ELAVL1抑制非小细胞肺癌

谢伟佳 1, 王友浩 1, 姚张（音） 1, 迎祥 1, 吴娜（Na Wu） 1, 吴龙 1, 李成英 1, 蔡同建 1, 马翔宇 1, 于祖宾 2, 李白 3, 李亚飞 1
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单核苷酸多态性rs4142441和MYC共同调制的长非编码RNA OSER1-AS1通过隔离ELAVL1抑制非小细胞肺癌

谢伟佳等。 癌症科学. 2021年6月.

摘要

单核苷酸多态性（SNP）和长非编码RNA（lncRNAs）参与了肺癌的发病过程。根据肺癌风险相关SNP提供的线索，我们旨在寻找新的功能性lncRNA作为肺癌的候选靶点。我们通过肺癌风险相关SNP rs4142441鉴定了一个lncRNA氧化应激反应性富含丝氨酸1反义RNA 1（OSER1-AS1）。OSER1-AS1在肿瘤组织中表达下调，其低表达与非小细胞肺癌（NSCLC）患者中非吸烟者总体生存率低显著相关。获得和丧失功能的研究表明，OSER1-AS1在体外通过抑制肺癌细胞的生长、迁移和侵袭而起到抑癌作用。异种移植瘤实验和转移小鼠模型证实OSER1-AS1抑制体内肿瘤生长和转移。OSER1-AS1的启动子被MYC抑制，OSER1-ASP1的3'端被microRNA hsa-miR-17-5p和RNA结合蛋白ELAVL1竞争性靶向。我们的结果表明，OSER1-AS1通过充当ELAVL1诱饵，使其远离靶mRNA，从而发挥肿瘤抑制功能。我们的发现将OSER1-AS1描述为非小细胞肺癌中一种新的肿瘤抑制lncRNA，表明OSER1-ASP1可能适合作为潜在的预后生物标志物和潜在的治疗靶点。

关键词：ELAVL1；OSER1-AS1；长非编码RNA；miR-17-5p；非小细胞肺癌。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
Rs4142441‐MUT与长非编码RNA（lncRNA）OSER1‐AS1的表达降低有关。A、 带有rs4142441野生型或突变等位基因的pGL3萤火虫荧光素酶报告质粒。Rs4142441‐WT代表带有rs414244野生型等位基因（A）的序列。Rs4142441‐MUT代表具有rs414244突变等位基因（G）的序列。B、 将含有rs4142441野生型或突变等位基因的pGL3萤火虫荧光素酶报告质粒瞬时转染到H1299细胞中，并将其转染至H1299中雷尼利亚荧光素酶报告子进行标准化。48小时后测量荧光素酶活性。数据以单独转染（n=3）的平均值和标准偏差（SD）表示。误差条代表SD。**曼惠特尼U型测试，P（P） < .01. C、 带有CMV启动子的pcDNA3.1质粒被OSER1‐AS1的启动子区域取代（rs4142441两侧±1000 bp）。Rs4142441‐WT代表带有rs414244野生型等位基因（A）的序列。Rs4142441‐MUT代表Rs4142441的突变等位基因（G）序列。将OSER1‐AS1的cDNA序列（转录ID：ENST00000442383.1）插入多克隆位点。D、 在转染48小时后测量OSER1‐AS1表达水平。相对归一化表达水平计算为rs4142441‐WT（A）载体表达水平相对于rs414241-MUT（G）的倍数变化，归一化为β-actin的表达水平。数据表示为单独转染的平均值和标准差（n=3）。误差条代表SD。**曼惠特尼U型测试，P（P） < .01
图2
图2
OSER1‐AS1在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中表达下调，并与癌症基因组阿特拉斯肺腺癌（TCGA‐LUAD）患者的总体生存率低相关。A、 非小细胞肺癌组织中OSER1‐AS1相对表达的qRT‐PCR分析，与配对的相邻正常肺组织进行比较。左侧面板：所有组。中间面板：吸烟者组。右侧面板：非吸烟者组。使用Wilcoxon配对符号秩检验比较肿瘤与邻近正常肺组织之间的差异表达：**P（P） < .01; ***P（P） < .001. B、 表达OSER1‐AS1高表达和低表达水平的TCGA‐LUAD患者总生存率（OS）的Kaplan‐Meier曲线。左侧面板：整体组。中间面板：吸烟者组。右侧面板：非吸烟者组。使用对数秩检验比较高表达组和低表达组（除以OSER1‐AS1表达中值）之间的生存差异
图3
图3
OSER1‐AS1的过度表达抑制肺癌细胞在体内的生长和转移。A、 皮下注射稳定转染A549细胞（5.0×106)进入左翼。B、 OSER1‐AS1和载体对照组的肿瘤重量。线表示五个独立实验的平均值和SEM。**，OSER1‐AS1 vs病媒控制，Mann‐WhitneyU型测试，P（P） < .01. C、 肿瘤体积使用以下公式计算V（V） = 0.5 × D类 × d日 2(V（V），体积；D类，纵向直径；d日，纬向直径）。线表示五个独立实验的平均值和SEM。ns（无显著性），OSER1‐AS1 vs病媒控制，Mann‐WhitneyU型测试，P（P）>0.05。D、 各组裸鼠在注射稳定转染A549细胞（1.0×10）5周后的肺6). 顶部面板：箭头指向肺部表面的肿瘤结节。底部面板：统计肺部表面的肺转移结节数量*OSER1‐AS1 vs病媒控制，Mann‐WhitneyU型测试，P（P） < .05. E、 左面板：肺组织切片的H&E染色显示，与OSER1‐AS1过度表达组相比，载体对照组存在更多的转移性结节。放大倍数，×200。右侧面板：增殖标记Ki‐67的免疫组化分析表明，OSER1‐AS1过度表达组的Ki‐）67表达水平显著低于对照载体组
图4
图4
MYC直接与长非编码RNA（lncRNA）OSER1‐AS1的启动子区域结合。A、 UCSC Genome Browser表示人类染色体中OSER1‐AS1基因启动子区域的基因组组织（hg19，chr20:42839726‐42854667），其中外显子由实心蓝框表示，内含子由蓝线表示。Rs4142441表示为垂直红色条。Primer轨迹显示了用于检测OSER1‐AS1启动子序列的两对引物的结合位置。F底漆、前底漆；R底漆，反向底漆。转录因子ChIP‐seq聚类追踪显示了转录因子结合区域，这些区域源自ENCODE项目执行的大量ChIP‐）seq实验。POLR2A框代表RNA聚合酶II亚单位A的转录因子占用峰值簇，而MYC框代表MYC的转录因子占据峰值簇，框的黑暗程度与在任何促成该簇的细胞系中观察到的最大信号强度成正比。B、 进行ChIP‐PCR检测MYC是否直接与OSER1‐AS1启动子结合。左侧面板：底漆对1。右侧面板：底漆对2。误差条表示三个独立实验的SD。双尾学生t吨测试：**P（P） < .01. C、 OSER1‐AS1启动子区的qRT-PCR产物。在ChIP后进行qRT‐PCR，使用两对引物扩增OSER1‐AS1的启动子区域。输入：输入控制1%总DNA，不添加任何抗体进行浓缩。MYC：被MYC抗体拉下的DNA片段。IgG：由IgG抗体拉下的DNA片段（用作阴性对照）。D、 利用rs4142441‐WT（A）或rs414241-MUT（G）启动子序列和MYC过表达载体或控制载体，对与pGL3‐basic‐OSER1‐AS1报告子共转染的H1299细胞进行荧光素酶分析。E、 用MYC过表达载体转染后H1299细胞中OSER1‐AS1相对表达的qRT‐PCR分析。数据表示为单独转染的平均值和标准偏差（SD）（n=3）。误差条代表SD。双尾学生t吨测试：*P（P） < .05. F、 OSER1‐AS1启动子区MYC结合基序及其相对于SNP rs4142441的位置。G、 示意图总结了OSER1‐AS1启动子区MYC和POLR2A的假设结合机制。H、 显示SNP rs4142441对转录因子结合能力的影响的EMSA。生物素-P：生物素标记的DNA探针。冷‐P（A/G）：未标记的竞争探针（rs4142441（A/G。冷SP1，未标记的非竞争性探针（SP1）用作阴性对照。抗体-MYC，MYC的特异性抗体。抗体-POLR2A，针对POLR2A的特异性抗体
图5
图5
OSER1‐AS1和ELAVL1之间的长非编码RNA（lncRNA）-蛋白质相互作用。A、 使用对照IgG、抗ELAVL1或抗AGO2抗体在H1299细胞中进行RNA免疫沉淀（RIP）。免疫沉淀OSER1‐AS1 RNA通过qRT-PCR定量。细胞裂解液中RNA-蛋白复合物的相对丰度表示为对照IgG（左Y轴）的标准化倍数或输入百分比（右Y轴）。误差条表示三个独立实验的SD。双尾学生t吨测试：*P（P） < .05; **P（P） < .01; ***P（P） < .001. B、 敲除OSER1‐AS1并过度表达后，通过western blot检测H1299细胞中ELAVL1和AGO2的蛋白表达水平。在转染后48小时收集细胞裂解物进行western印迹。条带下方的数字表示定量分析结果的折叠变化。β-actin被用作全细胞和细胞质细胞裂解物的阳性对照。组蛋白H3用作细胞核裂解物的阳性对照
图6
图6
OSER1‐AS1对H1299细胞中MYC、BCL2L11和miR‐17‐5p表达水平的影响。A、 敲除OSER1‐AS1并过度表达后，通过western blot检测H1299细胞中MYC和BCL2L11的蛋白表达水平。在转染后48小时收集细胞裂解物进行western印迹。条带下方的数字表示定量分析结果的折叠变化。β-actin被用作细胞质细胞裂解物的阳性对照。组蛋白H3用作核细胞裂解物的阳性对照。B、 OSER1‐AS1过度表达或敲低后，细胞核和细胞质细胞裂解物中MiR‐17‐5p的表达水平。C、 OSER1‐AS1过表达或敲低后，细胞核和细胞质细胞裂解物中BCL2L11的表达水平。误差条表示三个独立实验的SD。双尾学生t吨测试：*P（P） < .05; **P（P） < .01
图7
图7
提出的模型描述了OSER1‐AS1作为非小细胞肺癌（NSCLC）中非编码RNA（lncRNA）的肿瘤抑制因子的潜在机制。左图：在肿瘤进展的情况下，OSER1‐AS1被细胞核中的转录因子MYC抑制，而被细胞质中的miR‐17‐5p抑制。ELAVL1从细胞核转运到细胞质，以稳定MYC的mRNA并提高其翻译效率。MYC蛋白反过来下调OSER1‐AS1和BCL2L11，上调miR‐17‐5p。右面板：在肿瘤抑制场景中，OSER1‐AS1的细胞质水平增加到能够克服miR‐17‐5p的抑制作用的水平。游离细胞质OSER1‐AS1与ELAVL1形成RBP‐RNA复合物，将其与靶MYC mRNAs和可能由ELAVB1调节的其他致癌基因隔离
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