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.2021年5月；112(5):1822-1838.
doi:10.1111/cas.14703。 Epub 2021年3月8日。

表达癌基因KRAS的具有胆道上皮干细胞特性的类有机物引起小鼠胆道癌

Akiyoshi Kasuga先生 1 2, 塔卡西·森巴 1 三, 佐藤隆夫 1 4, Hiroyuki Nobusue先生 1, 杉原英治 1 5, Hiromasa Takaishi先生 2, 塔卡诺里·卡奈 2, Saya秀行 1, 吉米·阿里马 1
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表达癌基因KRAS的具有胆道上皮干细胞特性的类有机物引起小鼠胆道癌

Akiyoshi Kasuga先生等。 癌症科学. 2021年5月.

摘要

胆道癌（BTC）起源于胆道上皮细胞（BEC），包括肝内胆管癌（IHCC）、胆囊癌（GC）和肝外胆管癌（EHCC）。虽然已确定INK4A/ARF基因座上频繁的KRAS突变和表观遗传学改变，但BTC的分子发病机制尚不清楚，相应抗癌药物的开发仍不充分。我们从小鼠肝内胆管、胆囊和肝外胆管中分离出上皮细胞粘附分子（EpCAM）阳性的BEC，并建立从这些细胞衍生的类器官。将活化的KRAS和Ink4a/Arf纯合缺失引入每种器官型细胞中，可以形成具有分化成分的致命转移性腺癌，并在将细胞移植到同基因小鼠中时产生明显的促结缔组织增生反应，表明操纵细胞对应于BTC起始细胞。同基因小鼠模型概括了人类IHCC、GC和EHCC的病理特征，因此它们应该被证明对BTC致癌的研究和新的治疗策略的开发有用。从原发性肿瘤中分离出来的肿瘤细胞在三维培养中形成了类器官，对这些细胞进行的系列同基因移植表明，它们的肿瘤干细胞特性得到类器官培养的支持，而不是粘附培养的支持。因此，粘附培养减弱了致瘤活性以及上皮和干细胞标记物的表达，而上皮-间充质转化（EMT）相关转录因子基因和间充质细胞标记物则被诱导表达。我们的数据表明，类器官培养对于维持BTC起始细胞的上皮细胞特性、干细胞和致瘤活性非常重要。

关键词：胆道癌；肿瘤干细胞；胆管癌；上皮-间充质转化；类有机物培养。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
小鼠胆道上皮细胞（BEC）的分离和类器官培养。A、 小鼠肝脏、胆囊（GB）、肝外胆管（EHBD）和十二指肠的代表性大体形态。肝内胆管位于肝脏内。B、 小鼠胆道（IHBD、GB和EHBD）中EpCAM和CK19的H&E染色和IHC。比例尺，100μm。C、 EpCAM的FACS+CD31型−CD45型−来自肝单细胞消化物（IHBD）、GB和WT和EHBD的细胞墨水4a/Arf −/−老鼠。D、 如（C）中分离的细胞形成的类器官被破坏，并接受EpCAM的流式细胞术分析。对照组表示用对照IgG染色。E、 来自WT和墨水4a/Arf −/−老鼠。比例尺，100μm。F、 WT和CK19的BEC类有机物的EpCAM和CK的H&E染色和IHC墨水4a/Arf −/−老鼠。比例尺，100μm
图2
图2
建立表达KRAS（G12V）的小鼠胆道上皮细胞（BEC）类器官。A、 流式细胞术分析BEC中GFP表达的代表性点图墨水4a/Arf −/−感染编码KRAS（G12V）和GFP的逆转录病毒的小鼠。B、 类有机物培养物的亮场和荧光图像墨水4a/Arf −/−BEC感染了仅编码GFP或同时编码KRAS（G12V）和GFP的逆转录病毒。比例尺，100µm。C、 EpCAM和CK19的H&E染色和IHC墨水4a/Arf −/−感染GFP（对照）或KRAS（G12V）‐GFP病毒的BEC类有机物。比例尺，100μm。D、 免疫印迹分析p16、GFP和KRAS以及WT-BEC和WT-BEC中ERK和Akt的总形式和磷酸化形式墨水4a/Arf −/−BEC感染（或未感染）GFP（对照）或KRAS（G12V）‐GFP病毒。β‐肌动蛋白被检测为负荷控制
图3
图3
KRAS（G12V）表达的肿瘤形成墨水4a/Arf −/−WT C57BL/6J小鼠的胆道上皮细胞（BEC）。A、 肝内注射KRAS（G12V）4周后形成的肿瘤的宏观和微观外观-表达墨水4a/Arf −/−IHBD–、GB–或EHBD–衍生BEC（5×104细胞）。发光二极管（LED）图像显示GFP荧光。为了进行显微镜分析，对肿瘤切片进行H&E染色，并对GFP、CK19、α-SMA和磷酸化（p‐）形式的ERK和Akt进行IHC染色。比例尺，100μm。B、 注射表达KRAS（G12V）4周后形成的肿瘤中GFP、CK19和α-SMA的C、H&E染色和IHC墨水4a/Arf −/−BEC（5×104细胞）在同基因WT小鼠的皮下（B）或肾包膜下（c）。比例尺，100µm。D、 皮下注射KRAS（G12V）后3、7或14天形成的肿瘤中GFP、α-SMA和波形蛋白的H&E染色和IHC表达墨水4a/Arf −/−IHBD电池（1×104细胞）。比例尺，100μm
图4
图4
KRAS（G12V）形成的肿瘤微环境-表达墨水4a/Arf −/−WT C57BL/6J小鼠的胆道上皮细胞（BEC）。A、 肝内注射KRAS（G12V）后4周形成的肿瘤中CD31、F4/80、CD4、CD8的Masson三色染色和IHC以及细胞增殖标记物Ki67表达墨水4a/Arf −/−肝内胆管（IHBD）衍生BEC（5×104细胞）。比例尺，100μm。B、 流式细胞术分析接种前IHBD肿瘤起始细胞（TICs）和肝内注射IHBD TICs（IHBD瘤）4周后分离的肿瘤衍生细胞（TIC）中PD-L1的表达。将这些细胞与APC结合的鼠抗小鼠PD‐L1单克隆抗体（红线）孵育。APC结合大鼠IgG被用作同种对照抗体（黑线）。下图显示了GFP阳性肿瘤细胞和GFP阴性基质细胞中PD-L1的表达。C、 皮下注射IHBD、胆囊（GB）或肝外胆管（EHBD）TICs（5×10）后4周分离的肿瘤细胞中PD-L1表达的流式细胞术分析4单元格）。将来源于IHBD、GB或EHBD肿瘤的细胞与APC偶联的鼠PD-L1单克隆抗体（分别为红色、绿色或蓝色线）孵育。将来自IHBD肿瘤的细胞与同种对照抗体（APC结合大鼠IgG，黑线）孵育。还显示了表达PD-L1的GFP阳性肿瘤细胞和GFP阴性基质细胞的百分比
图5
图5
表达KRAS（G12V）的高致瘤性和转移能力墨水4a/Arf −/−胆道上皮细胞（BEC）。A、 皮下注射KRAS（G12V）后形成的肿瘤体积的时间进程-表达墨水4a/Arf −/−BEC（5×104细胞）。数据为平均值±SD。B、 （A）中小鼠的Kaplan-Meier生存分析。C、 （A）中小鼠初始肿瘤形成和肺转移的发生率。皮下注射细胞4周后形成的肺转移灶中GFP的H&E染色和IHC也显示出来。D、 小鼠皮下注射不同数量的墨水4a/Arf −/−BEC单独表达GFP或同时表达KRAS（G12V）和GFP。E、 单个KRAS（G12V）形成的类有机物亮场（低倍和高倍）和荧光图像-表达墨水4a/Arf −/−单细胞克隆后的IHBD细胞。比例尺，100μm。F、 皮下注射具有单细胞克隆（5×10）的同基因WT小鼠4周后形成的肿瘤的H&E染色4细胞）来源于类器官培养，如E.比例尺所示，100μm
图6
图6
肿瘤干细胞（CSC）的特性由类器官培养支持，但不由粘附培养支持。A、 皮下注射KRAS（G12V）后6周形成的原发性肿瘤细胞中GFP表达和碘化丙啶（PI）染色的流式细胞术分析墨水4a/Arf −/−胆道上皮细胞（BECs）（5×104细胞）。GFP的百分比+圆周率–显示了每个原发肿瘤的细胞。B、 GFP和CK19的H&E染色和IHC用于从肿瘤中分离的GFP阳性细胞衍生的次生类有机物，如（A）所示。比例尺，100μm。C、 皮下移植继发性TICs（5×104)如（B）所示，在有机物培养基中保存。比例尺，100µm。D、 WT C57BL/6J小鼠皮下注射一定数量的继发性TICs后肿瘤形成的发生率，这些TICs一直保存在类器官或贴壁培养物中。E、 流式细胞术分析在器官样或贴壁培养的原发性和继发性TIC中EpCAM、CD133和Sca‐1的表达。F、 通过IHBD、GB和EHBD细胞微阵列分析确定的胆道CSC标记基因表达热图，如（E）所示。
图7
图7
胆道癌（BTC）模型中EMT相关基因的表达。A、 次级肿瘤起始细胞（TIC）中EMT基因集微阵列数据的GSEA，这些细胞一直保存在贴壁或类器官培养物中。NES，归一化富集分数；FDR，错误发现率。B、 如图6E所示，对整个细胞裂解液中的E-cadherin、EpCAM和vimentin进行免疫印迹分析。C、 IHBD克隆1（5×10）形成的原发性肿瘤中GFP、EpCAM、CK19、ZEB1和波形蛋白的H&E染色及IHC4细胞）。上部面板中的方框区域在下部面板中以较高的放大倍数显示。比例尺，100µm。D、 IHBD克隆1（5×10）形成的原发性肿瘤中GFP和CK19或波形蛋白的免疫荧光分析4细胞）。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。比例尺，100µm。E、 IHBD克隆1细胞（5×10）新受体皮下埋植4周后形成的继发肿瘤中GFP和波形蛋白的免疫荧光分析4细胞）来源于6周龄的原发性肿瘤，如（D）所示，然后在移植前在器官样或贴壁培养中保存4周。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。比例尺，100µm
图8
图8
单细胞克隆（IHBD克隆1）的原发性和继发性肿瘤起始细胞（TICs）中上皮-间充质转化（EMT）相关基因的表达。A、 免疫印迹法分析有机物培养中维持的初级TICs以及有机物或粘附培养中保持的次级TICs的全部裂解物中的EpCAM和波形蛋白。继发性TIC来源于皮下注射KRAS（G12V）后3或6周形成的肿瘤墨水4a/Arf −/−IHBD克隆1（5×104细胞）转化为同基因WT宿主。B、 RT和实时PCR分析Epcam公司,Zeb1号机组,Zeb2公司,蜗牛1,蜗牛2,扭转1、和扭转2细胞中的mRNA如（A）所示。数据通过以下数量进行标准化Gapdh公司mRNA的表达与初级TIC的相应值有关，是三次试验的平均值±SD*P（P）< .05, **P（P）< .01, ***P（P）<0.001与主要TIC或所示比较（学生配对t吨测试）
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