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.2021年1月；70(1):227-239.
doi:10.2337/db20-0375。 Epub 2020年10月13日。

长非编码RNA马拉特1糖尿病视网膜病变抗氧化防御系统的调节

拉凯什·拉德哈克里希南 1, 雷努A科鲁鲁 2
附属公司

长非编码RNA马拉特1糖尿病视网膜病变抗氧化防御系统的调节

拉凯什·拉德哈克里希南等。 糖尿病. 2021年1月.

摘要

糖尿病患者视网膜氧化应激增加，Nrf2的转录活性降低，而Nrf2对许多抗氧化基因的调节至关重要。Nrf2的核运动/转录活性由其细胞内抑制剂Keap1介导，糖尿病患者视网膜Keap1水平升高。基因表达也受长非编码RNA（LncRNAs）调控。我们的目的是研究LncRNA的作用马拉特1糖尿病视网膜病变中Keap1-Nrf2抗氧化防御的调节。LncRNA马拉特1研究了高糖暴露后视网膜内皮细胞的表达（定量实时PCR、免疫荧光和RNA测序）、与Keap1（FACS）的相互作用、Keap1-Nrf2相互作用以及抗氧化反应基因的转录（免疫荧光和核RNA测序。葡萄糖增加LncRNA马拉特1通过增加Sp1转录因子在其启动子处的结合来提高水平。LncRNA的下调马拉特1通过其siRNA阻止葡萄糖诱导的基亚1促进Nrf2核转位和抗氧化基因转录。链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠和患有糖尿病视网膜病变的人类供体的视网膜微血管也表现出类似的LncRNA增加马拉特1及其与基亚1Nrf2介导的抗氧化防御基因减少。因此，LncRNA马拉特1，通过Keap1-Nrf2调节糖尿病视网膜病变的抗氧化防御。抑制LncRNA马拉特1具有保护视网膜免受氧化损伤和预防或减缓糖尿病视网膜病变的潜力。

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数字

图1
图1
高糖对LncRNA的影响马拉特1在视网膜内皮细胞中的表达。A类：对HG或NG中培养的HREC进行Lnc分析RNA MALAT1以β-肌动蛋白为看家基因，通过qRT-PCR进行表达。从NG中的细胞获得的值被视为1。B类：蔡司拍摄的代表性图像（原始放大倍数×40；Apotome模块客观放大倍数）显示定位和亚细胞表达，通过RNA-FISH技术，使用荧光素dUTP（绿色）扩增寡聚探针PCR，并用DAPI（蓝色）进行复染。C类：LncRNA的AMI马拉特1，根据每组30个或更多细胞的核区感兴趣区域计算。图表中的值表示为平均值±SD，从3-4个细胞制备中获得，每次测量重复一次。SC，加扰控制RNA*P（P）与NG和#P（P）与HG相比<0.05。
图2
图2
高糖对LncRNA的影响马拉特1-Sp1相互作用。A类：LncRNA的克隆化马拉特1使用荧光素12-dUTP标记的LncRNA通过RNA-FISH技术测定Sp1马拉特1探针（绿色）和德克萨斯红（红色）结合的Sp1二级抗体。B类：皮尔逊相关显示LncRNA之间的相互作用系数马拉特1和Sp1，使用每组30-40个细胞的核区域中的随机感兴趣区域计算。C类：LncRNA的Sp1占用马拉特1使用IgG（^）作为抗体对照，通过ChIP技术定量启动子。D类：LncRNA马拉特1使用RNA免疫沉淀技术对Sp1免疫沉淀样品进行定量。E类：ChIP序列显示Sp1-免疫沉淀染色质的比较峰及其在LncRNA上的占据模式马拉特1RPKM正常排列中的启动子。LncRNA上的核小体重塑马拉特1Sp1结合位点的启动子通过微球菌核酸酶辅助核小体DNA测序进行评估，图中显示了启动子位点和基因体的核小体DNA重塑模式。图表中的值表示为平均值±SD，NG值被视为1*P（P）<0.05与NG#P（P）与HG相比<0.05。SC，加扰控制RNA。
图3
图3
Keap1的调节LncRNA MALAT1.A类：通过FACS分析在高糖或正常葡萄糖中培养的HRECLncRNA MALAT1和Keap1双重染色。B类：第三象限中的LncRNA MALAT1-和Keap1-染色细胞。C类:基亚1以β-actin为看家基因，采用qRT-PCR检测基因表达。从正常葡萄糖中的细胞获得的值被视为1。D类和E类：通过Western blotting测定Keap1的表达(D类)以β-肌动蛋白为负载蛋白，通过免疫荧光(E类)使用德克萨斯红共轭二次染色（红色）和含DAPI（蓝色）的Vectashield安装试剂。Keap1的AMI是使用整个细胞面积上的感兴趣区域计算的。图表中的值表示为平均值±SD，从3-4个细胞制备中获得，每次测量重复一次。NG值被视为1*P（P）<0.05与NG#P（P）与HG相比<0.05。SC，加扰控制RNA。
图4
图4
的影响MAL公司-si对Keap1-Nrf2亚细胞定位的影响。A类：Keap1和Nrf2的克隆化分别使用德克萨斯红（红色）和荧光素结合（绿色）二级抗体通过免疫荧光测定。该线表示感兴趣的区域，用于确定Keap1-Nrf2的相互作用。B类：Keap1和Nrf2的Pearson相关性。C类：Nrf2与Keap1的结合是通过免疫沉淀细胞溶质Keap1进行的，随后进行Nrf2的Western blot分析，Keap1被用作负荷对照*P（P）<0.05与NG#P（P）与HG相比<0.05。SC，扰乱的对照RNA。
图5
图5
的影响MAL公司-Nrf2应答基因的si。A类和B类：的基因表达HO1公司(A类)和草皮2(B类)使用β-肌动蛋白作为持家基因通过qRT-PCR进行定量。从正常葡萄糖中的细胞获得的值被视为1*P（P）<0.05与NG#P（P）与HG相比<0.05。SC，扰乱的对照RNA。
图6
图6
的规定基亚1LncRNA的基因转录马拉特1和Sp1。A类：LncRNA马拉特1使用DNA寡核苷酸探针测定免疫沉淀效率LncRNA MALAT1.B类：LncRNA马拉特1绑定在基亚1使用荧光素-12-dUTP结合寡核苷酸（LncRNA）通过ChIRP技术对启动子进行定量马拉特1） 探针和RNA-免疫沉淀DNA片段定量LncRNA马拉特1在基亚1qRT-PCR启动子。C类：ChIP技术用于确定Sp1在基亚1通过对启动子进行qRT-PCR基亚1在Sp1-免疫沉淀染色质提取物中。IgG（^）用作抗体对照。D类:基亚1启动子活性通过荧光素酶测定进行定量，使用转录起始位点上游−800至下游+21的Sp1结合基序可能区域簇。每个图中的值表示为3-4个细胞制剂的平均值±SD*P（P）<0.05与NG#P（P）与HG相比<0.05。SC，加扰控制RNA。
图7
图7
通过核RNA测序进行基因表达和新合成。A类：两种不同细胞制剂的热图，分别在正常葡萄糖（NG1和NG2）和高糖（HG1和HG2）中培养。B类–D类：HG/NG的FPKM比率显示LncRNA MALAT1(B类);基亚1(C类); 和HO1公司,HQO1公司、和英尺1英寸(D类)在核分数中。
图8
图8
LncRNA MALAT1-糖尿病小鼠和有糖尿病视网膜病变记录的人类供体视网膜微血管中的Keap1。A类–D类：分析糖尿病小鼠（Diab）视网膜微血管的LncRNA马拉特1表达式(A类)通过qRT-PCR，LncRNA马拉特1在基亚1促进剂(B类)采用ChIRP技术通过荧光素dUTP结合寡核苷酸（LncRNA）定量马拉特1)免疫沉淀，然后量化基亚1(C类)和HO1公司和草皮2(D类)使用18S rRNA作为看家基因，通过qRT-PCR进行基因转录。从年龄匹配的正常小鼠（Nor）获得的值被视为1。E类–H（H）：分析患有糖尿病视网膜病变（Diab Ret）的人类供体视网膜微血管LncRNA MALAT1（qRT-PCR）(E类),LncRNA MALAT1在基亚1启动子（ChIRP）(F类)和的基因转录本基亚1(G公司)和HO1公司和草皮2(H（H）)通过qRT-PCR，以β-actin为看家基因。无糖尿病（非糖尿病）的人类捐赠者的值被视为1*P（P）与正常小鼠或无糖尿病的供体相比，<0.05。数值以平均值±SD表示，每组7-9只小鼠或每组6-7份人体样本进行两次测量。
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