跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

点政府

政府意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息,确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https(https)://确保您连接到官方网站,并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2021年3月;69(3):681-696.
doi:10.1002/glia.23920。 Epub 2020年10月12日。

细胞外聚集素限制小鼠和人星形胶质细胞对α-突触核蛋白原纤维的摄取

附属公司

细胞外聚集素限制小鼠和人星形胶质细胞对α-突触核蛋白原纤维的摄取

爱丽丝·菲利皮尼等。 格利亚. 2021年3月.

摘要

帕金森氏病(PD)的渐进性神经病理学损害被认为与α-突触核蛋白聚集形式的扩散有关。因此,清除退化神经元释放的细胞外α-突触核蛋白可能是控制细胞外空间α-突触核蛋白浓度的关键机制。一些分子伴侣控制细胞外室中错误折叠的蛋白质积累。其中,聚集蛋白是一种与阿尔茨海默病相关的糖蛋白,结合α-突触核蛋白聚集的物种,存在于路易小体中,神经元内聚集物主要由纤维性α-突触核蛋白组成。在这项研究中,我们使用具有聚集蛋白基因缺失的小鼠原代星形胶质细胞、具有聚集蛋白沉默的人诱导多能干细胞(iPSC)衍生星形胶质细胞和两个与PD相关的动物模型,探索聚集蛋白如何影响星形胶质细胞清除α-突触核蛋白聚集体。我们的研究结果表明,星形胶质细胞通过依赖于动力学的内吞作用摄取α-突触核蛋白预制纤维(pffs),并且在细胞培养基中,α-突触核蛋白pffs暴露后,聚集素水平受到调节。具体而言,我们发现聚簇素与细胞外室中的α-突触核蛋白pffs相互作用,并且聚簇素/α-突触核蛋白复合物可以被星形胶质细胞内吞。从机制上讲,使用聚簇素敲除原代星形胶质细胞和聚簇素击倒hiPSC衍生星形胶质细胞,我们观察到聚簇素限制了细胞对α-突触核蛋白pffs的摄取。有趣的是,我们在腺相关病毒和α-突触核蛋白pffs注射小鼠模型中检测到聚集素水平增加,这表明这种伴侣在PD发病机制中起着关键作用。总之,我们的观察表明,聚集素可以限制星形胶质细胞对细胞外α-突触核蛋白聚集体的摄取,因此,有助于帕金森病的传播。

关键词:帕金森病;星形胶质细胞;集群蛋白;hiPSC;α-突触核蛋白。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
原代星形胶质细胞通过动力依赖性内吞作用摄取α-突触核蛋白预制纤维(pffs)。(a) 用α-synuclein pffs处理不同时间(1、4、8和16)的原代星形胶质细胞的细胞裂解物hr)使用α-突触核蛋白和GAPDH抗体进行免疫印迹。16的单体α-synuclein(M)以hr细胞和未处理细胞为对照。α-synuclein免疫印迹中的星号表示α-synuglein非特异性条带。(b) α-synuclein的定量标准化为GAPDH蛋白。数据代表四个独立实验,并表示为平均值±标准偏差数据分析采用单因素方差分析(ANOVA),然后采用Tukey的事后检验**第页=0.0061,α-synuclein pffs 4小时与α-synuglein M***第页=.0002,α-synuclein pffs 8小时与α-synuglein M***第页<0.0001,α-synuclein pffs 16hr与α-synuclein M的比较;# 第页=0.036,α-synuclein pffs 8小时与α-synuglein pff 1小时;## 第页=0.0012,α-synuclein pffs 16hr对α-synuclein pffs 1小时;$ 第页=0.0341,α-synuclein pffs 16hr与α-synuclein pffs的比较4 hr。(c)用α-syn核心蛋白pffs处理16小时的原代星形胶质细胞的最大强度Z投影共焦图像hr,α-synuclein(紫色)、早期内切体抗原1(EEA1)(绿色)和细胞核DAPI(蓝色)染色。比例尺10μm。(d) 用*α-突触核蛋白pffs和Dynasore或DMSO作为对照处理4小时的原代星形胶质细胞的最大强度Z投影共焦图像。比例尺5μm。(e) *α-synuclein pffs的定量显示为三个独立实验的荧光强度平均值(每个实验约50个细胞)。*α-突触核蛋白pffs的定量计算为荧光强度除以细胞面积(μm2). 数据表示为平均值±标准偏差并由unparied进行分析测试**第页= .0038. 图表中的各个点代表每个单独的实验[彩色图形可以在以下位置查看wileyonlinelibrary.com]
图2
图2
细胞外簇蛋白与α-synuclein预制纤维(pffs)相互作用。(a) 来自原代星形胶质细胞的培养基用α-突触核蛋白pffs处理16hr或带有单体α-synuclein(m)的人,用聚集蛋白抗体进行免疫印迹。Ponceau‐S染色用作负荷控制。(b) 聚集蛋白的定量标准化为细胞裂解物的GAPDH蛋白。数据来自八个独立实验,表示为平均值±标准偏差。使用未配对分析数据测试**第页= .0028. (c) α-Synuclein pffs(或单体α-synnuclein(M)处理16小时后,从原代星形胶质细胞总培养基中离心分离出α-syn核心蛋白pffshr用clusterin和α-synuclein抗体进行免疫印迹。α-突触核蛋白免疫印迹中的星号表明簇蛋白抗体剥离后仍存在簇蛋白带。(d) α-synuclein pffs处理16周的原代星形胶质细胞培养液中的Clusterin免疫沉淀hr用α-synuclein抗体进行免疫印迹。(e) 通过将α-突触核蛋白pffs与蛋白G微球结合的α-突触核蛋白pff与簇合蛋白结合的归一化,可以量化簇合蛋白-α-突变体pffs的相互作用。数据代表三个独立实验,并表示为平均值±标准偏差使用一个样本分析数据测试*第页= .0493.(f)经α-synuclein pffs处理的原代星形胶质细胞的Z堆栈框架16hr,α-synuclein(紫色)、clusterin(绿色)、cadherin(红色)染色,细胞核DAPI(蓝色)染色。比例尺10μm。(g) α-synuclein pffs治疗16例原代星形胶质细胞的最大强度Z投影共焦图像hr,α-synuclein(紫色)、clusterin(红色)、Early Endosome Antigen 1(EEA1)(绿色)和细胞核DAPI(蓝色)染色。比例尺10μm。图表中的各个点代表每个单独的实验[彩色图形可以在以下位置查看wileyonlinelibrary.com]
图3
图3
细胞外聚集素限制小鼠原代星形胶质细胞对α-synuclein预制纤维(pffs)的摄取。(a) 使用聚集蛋白和GAPDH抗体对来自聚集蛋白野生型(WT)和敲除型(KO)星形胶质细胞的细胞裂解物进行免疫印迹。星号表示簇合素前体。(b) 用*α-synuclein pffs处理4小时的聚集蛋白WT和KO星形胶质细胞的最大强度Z投影共焦图像。标尺5μm。(c) *α-synuclein pffs的定量显示为六个独立实验的荧光强度平均值(每个实验约50个细胞)。*α-突触核蛋白pffs的定量计算为荧光强度除以细胞面积(μm2). 数据表示为平均值±标准偏差。使用未配对分析数据测试*第页= .0315. (d) 用pffs处理凝集素WT和KO原代星形胶质细胞的细胞裂解物16hr使用α-synuclein和GAPDH抗体进行免疫印迹。(e) 细胞内α-synuclein的定量标准化为GAPDH蛋白。数据代表八个独立实验,表示为平均值±标准偏差。使用未配对分析数据测试*第页= .0239。(f)来自用pffs处理16天的clusterin KO原代星形胶质细胞的细胞裂解物使用α-synuclein、clusterin和GAPDH抗体对含有或不含细胞外聚集素的培养基中的hr进行免疫印迹。(g) 细胞内α-synuclein的定量标准化为GAPDH蛋白。数据代表四个独立实验,并表示为平均值±标准偏差。使用未配对分析数据测试*第页= .0134. (h) 用pffs和氯喹(CQ)处理凝集素WT和KO原代星形胶质细胞的细胞裂解物16hr使用α-synuclein和GAPDH抗体进行免疫印迹。(i) 细胞内α-synuclein归一化为GAPDH蛋白的定量。数据代表了六个独立实验,并表示为平均值±标准偏差。使用未配对分析数据测试*第页= .0377. 图表中的各个点代表每个单独的实验[彩色图形可以在以下位置查看wileyonlinelibrary.com]
图4
图4
保护小鼠到人类星形胶质细胞对聚集素依赖性α-突触核蛋白预制纤维(pffs)的摄取。(a) hiAstrocytes的代表性图像(27分化天数)用α-synuclein pffs处理48天hr.比例尺10μm。(b) hiAstrocytes的细胞裂解物(27分化天数)用α-synuclein pffs或单体α-synuglein(m)处理48天hr使用α-synuclein和GAPDH抗体进行免疫印迹。α-synuclein免疫印迹中的星号表示α-synuglein非特异性条带。(c) 星形胶质细胞培养基(27分化天数)用α-synuclein pffs或单体α-synuglein(M)处理48天hr用凝集素抗体进行免疫印迹。Ponceau‐S染色用作负荷控制。(d) 聚集蛋白的定量标准化为细胞裂解物的GAPDH蛋白。数据代表三个独立实验,并表示为平均值±标准偏差。使用未配对的数据进行分析测试*第页= .0446.(e)hiAstrocytes的细胞裂解物(31分化天数)转染阴性对照(NC)或聚集素siRNA 24hr使用聚集蛋白和GAPDH抗体进行免疫印迹。聚集蛋白免疫印迹中的星号表示聚集蛋白的非特异性条带。(f) 聚簇素前体的量化标准化为GAPDH。数据代表三个独立实验,并表示为平均值±标准偏差。使用未配对分析数据测试*第页= .0165. (g) 星形胶质细胞的代表性图像(35分化天数)转染NC或clusterin siRNA并用*α-synuclein pffs处理24天hr.比例尺10μm。(h) *α-synuclein pffs的定量显示为三个独立实验的荧光强度平均值(每个实验约50个细胞)。*α-synuclein pffs的定量计算为荧光强度除以细胞面积(μm2). 数据表示为平均值±标准偏差。使用未配对分析数据测试*第页= .0178. 图表中的各个点代表每个单独的实验[彩色图形可以在以下位置查看wileyonlinelibrary.com]
图5
图5
在两种不同的帕金森病动物模型中,凝集素蛋白水平升高。(a) 注射腺相关病毒(AAV)-hα-synuclein的小鼠对侧和同侧腹侧中脑的裂解物,8天后处死周后使用聚集蛋白和GAPDH抗体进行免疫印迹。(b) 总裂解聚集蛋白的定量标准化为GAPDH蛋白。数据代表五种动物,表示为平均值±标准偏差使用一个样本分析数据测试*第页= .0253.(c)注射AAV‐hα-synuclein并于8天后处死的小鼠同侧和对侧纹状体中clusterin‐GFAP双重标记的代表性图像周。比例尺20微米。(d) 注射α-synuclein预制纤维(pffs)并于4天后处死的小鼠黑质中clusterin‐S100β双重标记的代表性图像周。比例尺20微米。(e) 注射α-synuclein pffs并于4天后处死的小鼠纹状体中clusterin‐S100β双重标记的代表性图像周。比例尺20μm[可在以下位置查看彩色图形wileyonlinelibrary.com]
图6
图6
图解假设。细胞外簇蛋白与α-突触核蛋白预制原纤维(pffs)结合,并掩盖与内吞作用或受体识别肽相关的pffs加工位点,从而限制星形胶质细胞对pffs的摄取。聚集素水平的表达减弱使α-synuclein pffs被表面受体处理和/或识别,从而提高了星形胶质细胞对α-syn核心蛋白pffs的清除率wileyonlinelibrary.com]

类似文章

引用人

工具书类

    1. Aflaki,E.、Stubblefield,B.K.、McGlinchey,R.P.、McMahon,B.、Ory,D.S.和Sidransky,E.(2020年)。Gaucher iPS衍生星形胶质细胞的特征:对帕金森病的潜在影响。疾病神经生物学,134104647 10.1016/j.nbd.2019.104647-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Bettuzzi,S.、Davalli,P.、Davoli,S.,Chayka,O.、Rizzi,F.、Belloni,L.…Sala,A.(2009)。ApoJ/clusterin基因失活:对前列腺肿瘤发生和转移扩散的影响。癌基因,28(49),4344–4352。10.1038/2009年1月28日-内政部-公共医学
    1. Bieri,G.、Gitler,A.D.和Brahic,M.(2018年)。纤维状α-突触核蛋白的内化、轴突运输和释放。疾病神经生物学,109(Pt B),219-225。2016年10月10日/j.nbd.2017.03.007-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Boggs,L.N.、Fuson,K.S.、Baez,M.、Churgay,L.、McClure,D.、Becker,G.和May,P.C.(1996年)。Clusterin(Apo J)可防止体外淀粉样蛋白β(1-40)神经毒性。神经化学杂志,67(3),1324-1327。10.1046/j.1471-4159.1996.67031324.x-内政部-公共医学
    1. Bonacini,M.、Coletta,M.,Ramazzina,I.、Napolli,V.、Modernelli,A.、Davalli,P.…Rizzi,F.(2015)。受表观遗传调控的不同启动子驱动前列腺癌细胞中两个簇合素mRNA的表达。生物化学与生物物理学报(BBA)——基因调控机制,1849(1),44–54。10.1016/j.bbagrm.2014.11.003-内政部-公共医学

出版物类型