G-四重链作为序列依赖性蛋白质伴侣
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A类 柠檬酸合成酶蛋白聚集分析的代表性示例。 在一个360 nm的多模平板阅读器中测量浊度和光散射，并在50°C下培养1.5小时。 蓝线代表三倍柠檬酸合成酶，红线和橙线代表与单个ssDNA序列孵育的三倍柠檬酸合成酶，绿色代表缓冲液。 B类 保持酶伴侣活性的ssDNA序列筛选。 每个条形代表不同的20 nt序列，按活动排序。 在50°C下孵育1.5小时后，将聚集%作为三份（技术复制）柠檬酸合酶浊度测量值的标准化平均值进行测量（图1A所示的典型示例）。 聚集度越低，保持酶功能越强。 最初的筛查使用随机、非冗余序列（顶部），这导致了后续强化筛查（底部）。 误差线为平均值±SE。 C类 通过分析屏幕发现的图案的HOMER徽标（使用HOMER默认设置的二项式分布进行统计以计算 P（P） 主题丰富的价值（Benner 等 , 2017): P（P） <1.0×10 −13 ，FDR<0.001，目标的百分比：53.85，背景的百分比：7.69）。
A类 柠檬酸合成酶通过360 nm直角光散射从化学诱导变性中聚集。 序列359、536和576都显示了保持酶活性，并且包含一个polyG基序。 序列42被用作阴性对照，因为它作为保持酶伴侣表现不佳，并且不包含polyG基序。 B类 热变性分析中不同浓度的选择四链体形成序列（序列359、536和576）和阴性对照序列（序列42）的聚集百分比。 浓度是ssDNA链与蛋白质的比率：0.5:1、1:1、2:1、4:1和8:1。 误差线为技术三倍的平均值±SE。 C类 柠檬酸合成酶在360 nm处通过直角光散射通过化学诱导变性聚集，作为序列359浓度的函数。
A类 在磷酸钠缓冲液中使用圆二色性对保持酶核酸的结构进行表征。 在260 nm和210 nm处观察到峰值，在245 nm处出现波谷，表明存在平行G‐四链体。 图EV2所示四链体在磷酸钾缓冲液中的热稳定性。 B类 在610 nm处测量NMM荧光。 误差线为技术三倍的平均值±SE。 C类 比较已知拓扑结构的不同四链体序列的保持酶活性（Sundquist&Klug，1989；Macaya 等 , 1993; 西蒙松 等 ，1998年； 海德尔 等 , 2002; 潘 等 , 2004; 安布罗斯 等 , 2005; 伦契克 等 , 2009; 布托夫斯卡娅 等 , 2018; 森加 等 , 2019). 误差线为技术副本的平均值±SE。
A、 C类 通过CD光谱仪测量的四链序列的热稳定性，其中每条线代表指示温度下的波长扫描。 B、 D类 在25℃退火之前或25℃退火之后，相同四链体序列在25℃下的二级结构。
A类 表达式向量构造。 这两种载体均受pBAD启动子控制，该启动子由0.2%诱导 L（左） 阿拉伯糖。 B类 存在或不存在蛋白质折叠增强因子时wtGFP的细胞荧光分析。 白色条（+Empty IN和+Seq42）表示阴性对照。 数据以平均值±SD表示( n个 =3）技术一式三份。 C类 体外 存在或不存在htDNA时wtGFP的重折叠。 GFP复性曲线评估GFP在60分钟孵育期内的荧光，变性GFP均存在于htDNA中( n个 =6）和缺乏htDNA( n个 = 6). 含htDNA的非变性GFP（天然）( n个 ＝4）作为对照。 数据显示为标准化为空白的每个实验条件的平均值，误差条表示为标准误差。 用技术复制品测试所有样品。
A类 表达载体的示意图。 蛋白折叠增强因子和TagRFP675的表达均受pBAD启动子的控制，pBAD的启动子由0.2%诱导 L（左） 阿拉伯糖。 B类 收集的细胞。 将空载体（阴性对照）、分子伴侣（GroEL、DnaK、Hsp33、Spy、ClpA、IbpA和IbpB）和选定的RNA序列（Seq42、Seq359、Seq536和Seq576）用作蛋白质折叠增强子。 NI和IN分别表示：非诱导和诱导。 C类 用不同蛋白折叠增强因子对TagRFP675进行细胞荧光分析。 在42℃诱导蛋白质表达，并用分光光度计测量每个样品的荧光。 白色条（+Empty IN和+Seq42）表示阴性对照。 数据显示为技术三等分的平均值±标准差( n个 = 3).
A类 化学诱导柠檬酸合成酶聚集的直角光散射。 以全时间标度作为插入物显示聚集的初始动力学。 B类 用四种不同的蛋白质在60°C下在DNA存在下变性的自旋下降分析。 S代表可溶部分，而P代表不溶部分或颗粒。 C类 热诱导聚集自旋下降分析中可溶性组分的透射电子显微镜负染图像。 虽然四倍体的形态取决于DNA序列，但在每个四倍体病例中都观察到柠檬酸合成酶低聚物。 相应的热变性自旋下降分析如面板（B）所示。 比例尺为100 nm。
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