Isolation and characterization of antibody fragments selective for human FTD brain derived TDP-43 variants

doi:10.1186/s12868-020-00586-0

.2020年9月4日；21(1):36.

doi:10.1186/s12868-020-00586-0。

人FTD脑源性TDP-43变异体选择性抗体片段的分离和鉴定

拉莉莎·文卡塔拉曼¹, 平和², 加拉姆·汗^三, 布伦特·哈里斯^三 4, 迈克尔·西克斯⁵

附属公司

¹美国亚利桑那州立大学生命科学学院。
²亚利桑那州立大学工程、物质、运输和能源学院化学工程，ECG301-501 Tyler Mall，Tempe，AZ，85281-6106，美国。
^三美国华盛顿乔治敦大学医学中心神经病学系。
⁴美国华盛顿乔治敦大学医学中心病理学系。
⁵亚利桑那州立大学工程、物质、运输和能源学院化学工程，地址：ECG301-501 Tyler Mall，Tempe，AZ，85281-6106，USA。sierks@asu.edu。

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内政部： 10.1186/s12868-020-00586-0

人FTD脑源性TDP-43变异体选择性抗体片段的分离和鉴定

拉利塔·文卡塔拉曼等。 BMC神经科学. 2020.

.2020年9月4日；21(1):36.

doi:10.1186/s12868-020-00586-0。

作者

拉莉莎·文卡塔拉曼¹, 平和², 加拉姆·汗^三, 布伦特·哈里斯^三 4, 迈克尔·西克斯⁵

附属公司

¹美国亚利桑那州立大学生命科学学院。
²亚利桑那州立大学工程、物质、运输和能源学院化学工程，ECG301-501 Tyler Mall，Tempe，AZ，85281-6106，美国。
^三美国华盛顿乔治敦大学医学中心神经病学系。
⁴美国华盛顿乔治敦大学医学中心病理学系。
⁵亚利桑那州立大学工程、物质、运输和能源学院化学工程，地址：ECG301-501 Tyler Mall，Tempe，AZ，85281-6106，USA。sierks@asu.edu。

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摘要

背景：额颞叶痴呆（FTD）是继阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease）之后的第二大早发性痴呆病因。它涉及大脑额叶和颞叶区域的萎缩，影响语言、记忆和行为。在大多数FTD和ALS病例中发现了反应性DNA-结合蛋白43（TDP-43）病理学。它在转录、翻译中起作用，并充当细胞核和细胞质之间的穿梭器。在聚集之前，TDP-43以多泛素化、超磷酸化的C末端片段的形式存在，与FTD疾病进展密切相关。由于TDP-43在这些疾病中的重要性，能够选择性识别与FTD发作和进展相关的特定毒性TDP变体的试剂可以成为有效的诊断和治疗工具。

结果：我们利用一种新型的基于原子力显微镜（AFM）的生物扫描协议，从噬菌体展示库中分离出单链可变片段（scFvs），该噬菌体显示库选择性结合人类FTD中存在的TDP变体，但不结合认知正常年龄匹配的脑组织。然后，我们使用scFvs（FTD-TDP1至5）检测死后脑组织和血清样本中是否存在FTD相关TDP变体。scFv在年龄匹配的对照组中容易选择FTD组织和血清样本。scFvs用于FTD和对照脑片的免疫组织化学分析，其中试剂在FTD脑组织切片中显示出强烈的TDP染色。FTD-TDP1、FTD-TDP2、FTD-TDP4和FTD-TDP5均能保护神经细胞免受FTD-TDP诱导的毒性，具有潜在的治疗价值。

结论：这些结果表明FTD患者中存在不同疾病特异性TDP变体。我们已经鉴定出一组单链抗体，能够在死亡后FTD组织和血清样本中识别这些疾病特异性TDP变体，并与年龄匹配的对照组进行比较，因此可以作为生物标记物工具。

关键词：生物标志物；脑组织；额颞叶痴呆；血清；TDP-43变体；标准立方英尺。

PubMed免责声明

利益冲突声明

M Sierks是Studio Biotherapeutics的联合创始人和CSO。所有其他作者都声明他们没有利益冲突。

数字

图1
AFM平移图像。原子力显微镜图像(一)噬菌体与BSA结合，然后进行减法平移以去除非特异性结合物(b)在用健康对照组织进行多轮消减筛选后，没有观察到噬菌体结合(**c（c）**)阳性选择后噬菌体与FTD-TDP-IP的结合

图2
用混合和单独FTD和对照脑组织匀浆筛选抗TDP噬菌体。对人类FTD脑源TDP变异体进行阳性选择后获得的噬菌体进行筛选(一)合并的人类FTD脑组织样本（n = 3），合并ALS脑组织样本（n = 3）和健康对照组（n = 2), (b)用单个FTD脑组织匀浆（n = 6）和健康控制。基于SEM的误差线

图3
用FTD和对照血清鉴定抗TDP单链抗体。使用夹心ELISA评估抗TDP单链抗体与FTD和AD血清的反应性。5种抗TDP单链抗体中的4种选择性结合到FTD-TDP（n = 12）和FTD-tau（n = 12）与AD血清（n = 11). 与认知正常健康对照组相比，FTDP-TDP5是唯一与FTD-TDP、FTD-Tau和AD血清具有反应性的单链抗体。基于SEM的误差线

图4
Western Blot分析。在非还原和非变性条件下，评估对健康对照组织和来自健康对照和FTD的TDP-43免疫沉淀的反应性(一)商业TDP抗体识别FTD和健康对照中的TDP变体，以及(b)识别TDP疾病变体的FTD-TDP2单链抗体(~ 70 kDa）存在于FTD和非健康对照中

图5
抗TDP单链抗体竞争ELISA。X轴表示每个scFv，Y轴表示与年龄匹配的控件的比率。用FTD血清（1个FTD-TDP+1个FTD-tau）（无竞争）或与其他四个scFv中的每一个预孵育的FTD血清（竞争）测试每个scFv。单因素方差分析表明，无竞争scFvs和竞争scFv之间没有显著差异。基于SEM的误差线

图6
抗TDP单链抗体的免疫组织化学。组织切片与(一)FTD-TDP2，或(b)FTD-TDP3（1:100）在4°C下摇晃过夜。应用抗scFv c-myc区的初级抗体（Sigma，1:1000，兔子）和MAP2（Covance，1:400，小鼠），然后使用荧光标记的山羊抗兔IgG（绿色）和山羊抗鼠IgG。用Leica SP5对切片进行观察和成像。比例尺代表50µm

图7
抗TDP单链抗体的治疗潜力。用来自人类FTD和对照脑组织的TDP-IP处理SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞株。用商业抗TDP抗体（ab190963，Abcam，1µg/mL）或抗TDP scFvs（FTD-TDP1，FTD-TDP2，FTD-TDP4和FTD-TDP5）进一步处理细胞12小时。通过测定乳酸脱氢酶（LDH）检测细胞损伤和毒性。商品化TDP抗体和FTD-TDP4均未在研究浓度下显著阻断FTD脑源性TDP IP的毒性，而FTD-TDP1、FTD-TDP2、FTD TDP3和FTD TDP5均显著抑制TDP诱导的毒性。基于SEM的误差线

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