Induced Liver Regeneration Enhances CRISPR/Cas9-Mediated Gene Repair in Tyrosinemia Type 1

doi:10.1089/hum.2020.042

.2021年3月；32(5-6):294-301.

doi:10.1089/hum.2020.042。 Epub 2020年10月16日。

诱导的肝脏再生增强CRISPR/Cas9介导的1型酪氨酸血症基因修复

张庆硕¹, 阿米塔·提亚布查伊¹, 肖恩·尼加德¹, 凯文·巴拉达尔¹, 安吉拉·梅杰², 尼维迪塔·巴拉吉¹, 马库斯·格朗普¹

附属公司

¹美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学俄勒冈干细胞中心儿科。
²美国德克萨斯州休斯顿市德克萨斯儿童医院病理科。

PMID： 32729326
预防性维修识别码： PMC7987361号
内政部： 10.1089/hum.2020.042

诱导肝再生增强1型酪氨酸血症患者CRISPR/Cas9-介导的基因修复

张庆硕等。人类基因疗法. 2021年3月.

.2021年3月；32(5-6):294-301.

doi:10.1089/hum.2020.042。 Epub 2020年10月16日。

作者

张庆硕¹, 阿米塔·提亚布查伊¹, 肖恩·尼加德¹, 凯文·巴拉达尔¹, 安吉拉·梅杰², 尼维迪塔·巴拉吉¹, 马库斯·格朗普¹

附属公司

¹美国俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康与科学大学俄勒冈干细胞中心儿科。
²美国德克萨斯州休斯顿市德克萨斯儿童医院病理科。

PMID： 32729326
预防性维修识别码： PMC7987361号
内政部： 10.1089/hum.2020.042

摘要

突变附近的CRISP/Cas9切口可提高肝脏同源重组的基因修复效率。在这项研究中，我们探索了旨在进一步增强体内遗传性酪氨酸血症模型中的肝细胞基因修复。采用双AAV系统：一种病毒携带化脓性葡萄球菌Cas9（SpCas9）表达盒，另一种病毒包含U6启动子驱动的sgRNA和延胡索乙酸酯水解酶片段(法赫)基因组DNA作为同源重组供体。在新生小鼠中，肝细胞的基因校正频率达到～10.8%。成年小鼠的效率显著低于-1.6%。为了确定肝细胞复制是否可以提高靶向频率，用甲状腺激素T3诱导细胞分裂。这将基因校正效率提高了一倍多，达到3.5%(第页< 0.005). 为了确定SpCas9的递送是否是速率限制性的，将基因修复AAV给予SpCas9转基因小鼠。然而，这并没有显著增强基因修复。最后，我们测试了范科尼贫血（FA）DNA修复途径在肝细胞基因修复中是否重要。在缺乏FA互补组A的新生小鼠中，基因校正频率显著降低(芬卡)基因。综上所述，我们得出结论，药物诱导肝细胞复制以及操纵DNA修复途径可能是增强体内基因修正。

关键词：AAV；CRISPR/Cas9；范科尼贫血；基因治疗。

PubMed免责声明

利益冲突声明

M.G.在Yecuris和Ambys Medicines拥有重大的财务利益，这两家公司可能对这项研究和技术的结果有商业利益（Fah mouse）。

数字

**图1。**
AAV矢量设计和实验时间表。**（A）**显示双AAV基因修复策略的示意图。AAV-sgRNA-repair病毒将U6驱动的sgRNA靶向PAM位点145 nt远离致病点突变法赫基因。它还包含一个与野生型小鼠同源的基因组DNA片段传真基因。点突变的位置集中在两个1.8-kb同源臂的中心。AAV-Cas9病毒携带s.p.Cas9表达盒。P3表示源自人类转甲状腺素基因的肝脏特异性启动子。**（B）**实验的时间线。时间以以下天数表示酒吧对于新生和成年小鼠，在病毒给药28天后采集肝组织。法赫，延胡索乙酸酯水解酶。在线提供彩色图像。

**图2。**
新生儿的基因矫正*传真^−/−*老鼠。**（A）**肝脏免疫组织化学。*顶部面板*：无NTBC选择的Fah染色代表性图片。比例尺（100 μm）如所示红色.（B）NTBC退出和选择Fah+肝细胞后Fah染色的代表性图片。首次给药4周后，将NTBC从饮用水中取出，4周后收获。**（C）**肝细胞基因校正频率的统计量化。数据是汇总结果(n个 = 11个）。**（D）**NTBC退出后的重量曲线。数据以平均值表示 ± 扫描电镜(n个 = 双病毒组为5，n个 = 仅接受一种病毒的两个对照组中的任一组各3例）。NTBC，2-（2-硝基-4-三氟甲基苯甲酰基）-1,3-环己二酮；SEM，平均值标准误差。在线提供彩色图像。

**图3。**
成人的基因矫正*法赫^−/−*老鼠。**（A）**成人典型免疫组织化学图片*法赫^−/−*老鼠。在收获肝脏进行Fah染色之前，使用8周龄成年小鼠进行AAV注射并监测4周以上。这个箭头表明肝细胞被抗Fah抗体阳性染色。**（B）**成人肝细胞基因校正频率的统计量化*法赫^−/−*老鼠。数据是汇总结果(n个 = 11个）。**（C）**比较AAV传递Cas9和组成性过度表达Cas9之间的基因校正效率。代表性免疫组化图片取自8周龄儿童*法赫^−/−案例9^Tg/Tg*和*法赫^−/−案例9^+/+*老鼠。这个箭头表明肝细胞被抗Fah抗体阳性染色。**（D）**肝细胞中基因校正频率的量化*法赫^−/−案例9^Tg/Tg*老鼠。数据来自7法赫^−/−案例9^Tg/Tg小鼠和4只*法赫^−/−*控制。在线提供彩色图像。

**图4。**
诱导肝再生的基因校正。**（A）**肝脏免疫组织化学。BrdU染色的代表性图片(*棕色的*). T3饮食组动物的标记指数显著增加。这个*黑色刻度条*表示100 微米。**（B）**Fah染色(*棕色的*)T3治疗和安慰剂治疗的成人*传真^−/−*老鼠。在收获肝脏进行Fah染色之前，使用8周龄成年小鼠进行AAV注射并监测4周以上。**（C）**肝细胞中基因校正频率的量化。数据是汇总结果(n个 = 每组12个）。BrdU，5-溴-2′-脱氧尿苷。在线提供彩色图像。

**图5。**
FA途径对新生小鼠AAV介导的基因纠正的影响。**（A、B）**Fah染色的典型免疫组织化学图片。新生儿和*芬卡^+/+法赫^−/−* **（A）**和*芬卡^−/−法赫^−/−* **（B）**小鼠在收获前接受AAV注射并监测4周。**（C）**Fanconi突变体和对照中基因修复频率的定量。每个圆圈代表一只鼠标。数据来自8个*芬卡^+/+法赫^−/−*小鼠和6只*芬卡^−/−法赫^−/−*三个实验中的小鼠。FA，范科尼贫血。在线提供彩色图像。

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[8] Paulk NK、Loza LM、Finegold MJ等。AAV介导的基因靶向性通过短暂抑制体内非同源末端连接或蛋白酶体而显著增强。Hum Gene Ther 2012；23:658–665-项目管理咨询公司-公共医学

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