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.2021年1月；9（1）：312-328。
doi:10.1111/andr.12865。 Epub 2020年8月5日。

精子中的YWHAE蛋白（14-3-3ε）对男性生育至关重要

阿拉·艾萨 1, Souvik Dey公司 2, 亚历克斯·伊格纳修斯 2, 韦萨姆·诺法尔 三, 雷克斯·A·赫斯 4, 马纳布·库洛卡瓦 2, 道格拉斯·克莱恩 2, 斯里尼瓦桑·维贾亚拉加万 2
附属公司

精子中的YWHAE蛋白（14-3-3ε）对男性生育至关重要

阿拉·艾萨等。 男性学. 2021年1月.

摘要

背景：精子发生是一个复杂的生物过程，在精子发生过程中，调节减数分裂和细胞分化的蛋白质的合成和激活是其突出表现。14-3-3蛋白是在激酶信号传导中起关键作用的衔接蛋白，特别是在真核细胞中调节细胞周期和凋亡。14-3-3家族蛋白有7种亚型，由7个基因编码（β、ε、γ、η、θ/τ、ζ和σ）。14-3-3亚型在包括睾丸在内的多种组织中有许多相互作用的伙伴。

目标：虽然已知14-3-3蛋白在睾丸和精子的功能中表达，但这七种异构体中每一种的作用尚不清楚。在本研究中，我们研究了14-3-3η和14-3-3ε亚型在精子发生中的作用。

材料和方法：为了研究14-3-3η和14-3-3ε在精子发生中的体内功能，我们分别为14-3-3γ和14-3-3-ε亚型（CKO和GKO）制造了睾丸特异性和全局敲除小鼠。计算机辅助精液分析用于评估精子活力，而免疫组织化学研究用于检查精子发生。

结果：虽然14-3-3η和14-3-3ε亚型都存在于小鼠睾丸中，但在精子中只检测到14-3-3¦Μ的表达，而没有检测到143-3η的表达。缺乏14-3-3η的小鼠正常且有生育能力，而14-3-3εCKO和GKO雄性小鼠表现为不育。14-3-3εCKO小鼠精子计数低，精子异常率高。14-3-3ε基因敲除精子的运动能力低于对照组。在14-3-3εCKO小鼠的精子中，还发现糖原合成酶激酶3和PP1γ2的磷酸化降低，表明14-3-3λ在精子发生、精子运动和生育中具有特殊作用。

讨论和结论：这是首次证明在七种14-3-3亚型中，14-3-3ε对正常精子功能和男性生育能力至关重要。

关键词：14-3-3; YWHA；不育；精子运动；精子发生。

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作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
A、 对WT小鼠睾丸和精子裂解物的Western blot分析显示，在睾丸和精子溶解物中检测到14-3-3ε。随后用β-微管蛋白对印迹进行探测，以显示相等的样品负荷。B、 在所示出生后的第二天，从幼崽身上采集了睾丸。用TRIzol试剂分离信使RNA。使用14-3-3ε的特异性引物和GAPDH引物作为看家基因，用qPCR定量14-3-3λmRNA的表达。14-3-3ε的表达随着年龄的增长而增加，在成熟成年人中表达最高。这些数据代表了一个三重实验，误差条代表了误差标准（SE）。C、 从WT小鼠中收集精子，用4%PFA固定45分钟，并以多克隆山羊抗14-3-3ε抗体或多克隆兔抗Pan 14-3-3抗体作为主要染色剂。然后用抗山羊抗体CY3或用Hoechst复染的抗兔抗体CY3对切片进行染色。使用共焦显微镜对细胞成像。Pan 14-3-3定位于顶体后区和中段，而14-3-3ε仅定位于小鼠精子的中段。D、 将WT小鼠的睾丸固定在Bouin的固定液中过夜，进行处理，并切成10μm的切片。切片用小鼠单克隆抗14-3-3ε抗体孵育，然后用次级抗鼠抗体CY3孵育并用Hoechst进行复染。14-3-3ε在分化生殖细胞中表达，但在位于生精小管第一层的精原细胞（白色箭头）中不表达
图2
图2
A、 全动物基因分型鉴定了那些具有全局和睾丸特异性基因缺失的雄性。如果存在上带，14-3-3εLoxP引物表明14-3-3基因上存在LoxP。较低的带表示WT，没有带表示可能的基因缺失（-/-）。14-3-3εKO引物表明，如果存在条带，则一个或两个等位基因缺失（Δ）。使用14-3-3εLoxP引物的LoxP带、KO引物中的一条带和Stra8 Cre中的一个带的存在表明存在生殖细胞特异性敲除（-/LoxP），因为第二个LoxP稍后将在睾丸中删除。另一方面，LoxP和WT条带的存在没有Cre（LoxP/WT）Cre阴性，表明该小鼠具有完整的功能基因和WT表型。对14-3-3εGKO和CKO的睾丸和精子裂解物进行（B和C）Western blot分析，以确认蛋白质的缺失。来自14-3-3εGKO的睾丸和精子裂解物没有14-3-3λ蛋白的表达。14-3-3εCKO在睾丸中的低表达是由于体细胞中存在该蛋白。用β-微管蛋白抗体重新进行印迹，以确认蛋白质负载量相等。D、 来自WT和14 3 3εCKO的睾丸切片用14-3-3ε（来自Santa Cruz的小鼠mAb 14-3-3λ8c3）的一级抗体孵育，然后用兔抗小鼠CY3（红色）孵育并用Hoechst（蓝色，细胞核）反染。使用共焦显微镜对多个切片进行成像。在与WT小鼠切片并行处理和成像的睾丸切片中，14-3-3εCKO动物的生精小管中未检测到蛋白质14-3-3
图3
图3
A、 通过体内繁殖转基因雄性和WT雌性小鼠来测试14-3-3εGKO和CKO小鼠的生育能力。记录每个类别至少3对繁殖对的平均出生幼崽数。14-3-3ε缺失的雄性在8周内没有产崽。（n） 表示繁殖对的数量。B、 在HTF培养基中提取WT和14-3-3εKOs的精子。然后将精子悬液稀释为1:10，用Neubauer血细胞仪测量精子计数。至少使用了三只小鼠进行分析。使用Prism软件进行方差分析测试。14-3-3εGKO和CKO精子显著低于WT精子数(P（P）-值=.0005）。所有图表中的误差条代表SE.C，14-3-3εCKO基因敲除雄性精子的体外受精。对于3只不同的14-3-3εCKO雄性和3只WT雄性，分别采集两只WT雌性的卵子并进行受精。14-3-3εCKO小鼠精子受精细胞中受精卵（发育到双细胞期）的百分比显著低于WT精子受精卵(P（P）-值<.0001）。图中显示了野生型雄性受精的三个代表性例子和双细胞发育百分比。图底部显示的图像代表了由野生型雄性精子和14-3-3εCKO雄性精子受精的受精卵
图4
图4
（A和B）从WT和14-3-3εCKO和GKO中提取精子，并在37°C和5%CO中培养2获能45分钟。使用CASA，测量每种类型的精子总活率和进行性活率。使用Prism软件分析各组间的显著性差异。对每只老鼠的至少五个不同区域进行测量并求平均值。由于胚胎致死性，成年14-3-3εGKO雄性的几率小于1%（11）。仅测量了一只14-3-3εGKO小鼠的精子运动和速度参数。然而，14-3-3εWT和CKO的运动能力和速度参数测量值是每个类别至少三只小鼠的平均值。这个t吨-测试显示，与WT相比，14-3-3εCKO的总运动和渐进运动显著降低P（P）-值<.0001。C、 测量了14-3-3εWT和CKO的速度参数（VAP、VSL和VCL）。与WT相比，14-3-3εCKO的速度参数明显更低P（P）-值<.0001。所有图形中的误差条代表SE
图5
图5
A、 在HTF培养基中提取WT和14-3-3εCKO雄性精子。细胞悬液与膜电位敏感染料MitoProbe™DiIC1（5）孵育；赛默飞世尔，M34151。用流式细胞仪测定强度。结果表明，缺乏14-3-3ε时线粒体膜电位显著降低(P（P）-值=.0104）。B、 收集野生型和敲除型精子，并通过第2节所述的荧光素酶分析测定ATP水平。14-3-3εCKO精子中的ATP水平显著低于WT精子。数值为平均值±SEM（n=4）；P（P）-值=.0038。14-3-3εGKO的ATP水平代表一个实验
图6
图6
A、 WT和14-3-3εCKO精子均在HTF培养基中提取，然后固定在4%PFA中。精子用DIC光学成像。箭头所示的异常形态如下：头部空泡状（黄色）、无定形（绿色）、头部弯曲（红色）、不规则中段（黑色）和无钩精子头部（蓝色）。B、 对WT（n=4）、14-3-3εCKO（n=3）和14-3-3λGKO（n=1）的精子进行异常计数。14-3-3εCKO精子中头部弯曲的异常精子显著增多(P（P）-值<.0001）
图7
图7
将来自WT（A）和14-3-3εGKO（B和C）和143-3εCKO（D-F）小鼠的睾丸固定在Bouin溶液中过夜。然后将组织脱水，包埋在石蜡中，并制备10μm厚的切片。组织切片再次水化，并用周期性酸-希夫（PAS）染色。14-3-3εGKO和CKO小鼠的睾丸生精小管腔内精子较少。一些精子似乎位于基底膜附近，这表明精子发生异常，向内腔的转运较差。敲除小鼠睾丸的异常用彩色箭头表示，如下所示：精子头紊乱和异常（黄色）；脱落细胞（红色）；伸长精子细胞丢失（蓝色）；精子排出失败（绿色）；细胞脱落的液泡（黑色）
图8
图8
A、 Western blot分析表明，已知或可能参与精子功能的蛋白质的表达或翻译后修饰可能在缺乏14-3-3ε的情况下发生改变。14-3-3εCKO精子显示GSK3α/β的丝氨酸和酪氨酸磷酸化降低。PP1的苏氨酸磷酸化也降低。随后用β-微管蛋白对印迹进行探测，以显示相等的样品负荷。B、 如材料和方法中所述，使用GS2肽作为底物测量GSK3的催化活性。单位活性定义为32PO42-掺入/min/107精子的nmoles。GSK3在14-3-3ε条件KO中的催化活性显著高于野生型精子。数值为平均值±SEM（n=6）；P（P）-值=.0077。C、 共免疫沉淀实验表明，14-3-3ε与PP1γ2作为PP1γ2中蛋白的相互作用被两种不同的14-3-3λ抗体（小鼠单克隆抗体和山羊多克隆抗体）所抑制。D、 相互免疫共沉淀实验表明，当PP1γ2 c末端抗体将14-3-3ε蛋白拉下时，其存在。（E和F）精子提取物探针与抗磷酸（Ser）14-3-3结合基序抗体的Western blot分析。E、 精子数调整为（1×107精子/μL）。小鼠头部和尾部精子提取液在TBS中分离后制成。F、WT和KO精子提取液是从悬浮在HTF中1小时的精子中制成的，以促进体外受精期间的获能。E和F的下面板显示了用β-肌动蛋白开发的印迹，以显示相等的负载。印记F的中间面板显示WT中存在14-3-3ε，但CKO中不存在
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    1. Dougherty MK，Morrison DK。解锁14-3-3的代码。细胞科学杂志。2004;117(10):1875–1884.-公共医学
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