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.2020年6月12日8:429。
doi:10.3389/fcell.2020.00429。 eCollection 2020。

长非编码RNA LINC01134通过激活AKT1S1和NF-κB信号通路促进肝细胞癌转移

王超（Chao Wang） 1, 闫晨 2, 陈昆仑 三, 张磊（Lei Zhang） 4
附属公司

长非编码RNA LINC01134通过激活AKT1S1和NF-κB信号通路促进肝细胞癌转移

王超（Chao Wang）等。 前电池开发生物. .

摘要

肝细胞癌（HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，预后较差。肝癌相关死亡的主要原因是复发和转移。长非编码RNA（lncRNAs）最近被确定为癌症的关键调节因子。然而，与肝癌复发和转移有关的lncRNA尚不清楚。在本研究中，通过分析癌症基因组图谱肝细胞癌数据集，我们发现了一种新的lncRNA LINC01134，它在肝癌组织中高度表达，并与肝癌患者的微血管侵袭、大血管侵袭、复发和整体生存率差相关。功能实验表明，LINC01134的异位表达促进了HCC细胞的迁移和侵袭在体外肝癌肝转移和肺转移体内LINC01134基因敲除抑制HCC细胞迁移和侵袭在体外肝癌肝转移和肺转移体内从机制上，我们发现LINC01134直接结合AKT1S1型并激活AKT1S1型表达式。通过激活AKT1S1，LINC01134进一步激活NF-κB信号传导。肝癌组织中LINC01134的表达与AKT1S1的表达呈显著正相关。与LINC01134一致，AKT1S1在HCC组织中也高表达，并与HCC患者的低生存率相关。功能性拯救实验表明，抑制AKT1S1或NF-κB信号转导可消除LINC01134在肝癌中的作用。总之，这些发现将LINC01134识别为一种新的致癌lncRNA，这表明HCC患者的血管侵袭、复发和总生存率低。LINC01134通过激活AKT1S1表达并随后激活NF-κB信号通路促进肝癌转移。本研究提示LINC01134是肝癌潜在的预后生物标志物和治疗靶点。

关键词：AKT1S1；NF-κB信号转导；肝细胞癌；长非编码RNA；转移。

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数字

图1
图1
LINC01134高表达，与肝癌患者预后不良相关。（A）LINC01134在肝癌组织中的表达(n个=369）与正常肝组织(n个=50）来自TCGA LIHC数据集。（B）根据TCGA LIHC数据集，对LINC01134表达水平与HCC患者总生存率之间的相关性进行Kaplan-Meier生存分析。（C）基于TCGA LIHC数据集的肝癌患者LINC01134表达水平与无病生存期相关性的Kaplan–Meier生存分析。（D）用qRT-PCR检测84对肝癌组织、配对的癌旁肝组织和20例PVTT组织中LINC01134的表达****第页< 0.0001. 通过Wilcoxon配对符号秩检验计算肝组织和HCC组织之间的比较。通过Mann-Whitney检验计算HCC组织和PVTT组织之间的比较。（E）Kaplan-Meier生存分析LINC01134表达水平与84例HCC患者总生存率之间的相关性。第页通过对数秩检验，=0.0118，HR=2.164。（F）这84例肝癌患者LINC01134表达水平与无病生存率之间相关性的Kaplan-Meier生存分析。第页通过对数秩检验，=0.0085，HR=2.059。
图2
图2
LINC01134促进肝癌细胞的迁移和侵袭。（A）用qRT-PCR检测LINC01134在稳定过表达和对照SK-HEP-1和HCCLM3细胞中的表达。（B）进行Transwell迁移分析以评估LINC01134稳定过度表达和对照SK-HEP-1和HCCLM3细胞的迁移能力。显示了迁移细胞的典型图像。比例尺=100μm。（C）进行Transwell侵袭试验以评估LINC01134稳定过度表达和对照SK-HEP-1和HCCLM3细胞的侵袭能力。显示侵袭性细胞的典型图像。比例尺=100μm。（D）用qRT-PCR检测LINC01134在稳定表达和对照HCCLM3和Huh7细胞中的表达。（E）进行Transwell迁移分析以评估LINC01134稳定筛选和对照HCCLM3和Huh7细胞的迁移能力。显示了迁移细胞的代表性图像。比例尺=100μm。（F）采用Transwell侵袭试验评估LINC01134稳定筛选和对照HCCLM3和Huh7细胞的侵袭能力。显示侵袭性细胞的典型图像。比例尺=100μm。结果显示为三个独立实验的平均值±SD**第页< 0.01, ***第页< 0.001, ****第页<0.0001，通过非配对双侧学生t吨-测试（A–C）或单因素方差分析，然后进行Dunnett的多重比较测试（D–F）.
图3
图3
LINC01134促进肝癌肝转移和肺转移体内.（A–C）将稳定过度表达的LINC01134和对照HCCLM3细胞脾内注射到裸鼠体内。注射后第28天（A）和尺寸（B）HE染色检测肝转移结节（C）.（D–F）将LINC01134稳定表达和对照的HCCLM3细胞脾内注射到裸鼠体内。注射后第28天（D）和尺寸（E）HE染色检测肝转移结节（F）.（G）将荧光素酶标记的LINC01134稳定过表达和对照HCCLM3细胞注射到裸鼠尾静脉。注射后28天，通过检测荧光素酶信号强度评估肺转移。（H）将荧光素酶标记的LINC01134稳定和对照HCCLM3细胞注射到裸鼠的尾静脉。注射后28天，通过检测荧光素酶信号强度评估肺转移。结果显示为的平均值±SDn个=每组6只小鼠**第页Mann–Whitney检验<0.01（A–C，G）或Kruskal–Wallis检验，然后是Dunn的多重比较检验（D–F，H）.
图4
图4
肝癌组织中AKT1S1和LINC01134的表达呈正相关。（A）来自TCGA LIHC数据集的AKT1S1和LINC01134表达强度之间的相关性。第页= 0.3876,第页斯皮尔曼相关分析显示<0.0001。（B）AKT1S1在肝癌组织中的表达(n个=369）与正常肝组织(n个=50）来自TCGA LIHC数据集。（C）根据TCGA LIHC数据集对AKT1S1表达水平与肝癌患者总生存率之间的相关性进行Kaplan-Meier生存分析。（D）采用qRT-PCR检测84对肝癌组织、癌旁组织和20例PVTT组织中AKT1S1的表达****第页< 0.0001. 采用Wilcoxon配对签名秩检验计算肝组织和肝癌组织之间的比较。HCC组织和PVTT组织之间的比较通过Mann–Whitney检验进行计算。（E）84例肝癌组织中LINC01134表达水平与AKT1S1表达水平的相关性。第页= 0.583,第页斯皮尔曼相关分析显示<0.0001。（F）这84名HCC患者AKT1S1表达水平与总生存率之间相关性的Kaplan–Meier分析。第页通过对数秩检验，=0.0037，HR=2.444。
图5
图5
LINC01134直接绑定AKT1S1型启动子和激活AKT1S1型表达式。（A）用qRT-PCR检测LINC01134稳定过表达和对照HCCLM3细胞中AKT1S1 mRNA的水平。（B）用qRT-PCR检测LINC01134稳定表达和对照HCCLM3细胞中AKT1S1 mRNA的水平。（C）western blot检测LINC01134稳定过表达和对照HCCLM3细胞中AKT1S1蛋白水平。（D）western blot检测LINC01134稳定表达和对照HCCLM3细胞中AKT1S1蛋白水平。（E）通过qRT-PCR在生化分级的HCCLM3细胞中分析LINC01134和对照转录物的亚细胞定位。NEAT1被用作染色质相关lncRNA对照。MALAT1被用作核浆放大的lncRNA对照。GAPDH mRNA被用作细胞质对照。（F）LINC01134（464–753 nt）和AKT1S1型启动子（−1802至−1498 bp）。（G）在HCCLM3细胞中使用LINC01134捕获探针进行ChIRP分析。The enrichment of theAKT1S1型发起人和GAPDH公司用qRT-PCR检测启动子。（H）野生型或互补区突变的LINC01134过表达质粒与萤火虫荧光素酶报告子瞬时共转染后，含有AKT1S1型启动子和pRL-TK（编码肾素荧光素酶）进入HCCLM3细胞，进行双荧光素素酶报告子分析以评估AKT1S1启动子活性。结果显示为萤火虫荧光素酶活性与肾盂荧光素酶活性的相对比率。（一）用萤火虫荧光素酶报告子瞬时共转染LINC01134特异性shRNAs后AKT1S1型启动子和pRL-TK进入HCCLM3细胞，进行双荧光素酶报告基因测定以评估AKT1S1启动子活性。结果显示为萤火虫荧光素酶活性与肾盂荧光素酶活性的相对比率。结果显示为三个独立实验的平均值±SD**第页< 0.01, ***第页<0.001，ns，不显著，由未配对的双边学生t吨-测试（A）或单因素方差分析后进行Dunnett多重比较检验（B、G–I）.
图6
图6
AKT1S1的抑制逆转LINC01134在肝癌中的作用。（A）用qRT-PCR和western blot检测LINC01134稳定过表达和同时表达AKT1S1稳定的SK-HEP-1细胞中AKT1S1mRNA和蛋白水平。（B）通过qRT-PCR和western blot检测LINC01134稳定过表达和同时AKT1S1稳定沉默的HCCLM3细胞中AKT1S1mRNA和蛋白水平。（C）进行跨阱迁移分析以评估LINC01134稳定过度表达和同时AKT1S1稳定沉默的SK-HEP-1和HCCLM3细胞的迁移能力。显示了迁移细胞的典型图像。比例尺=100μm。（D）进行Transwell侵袭试验以评估LINC01134稳定过度表达和AKT1S1稳定沉默SK-HEP-1和HCCLM3细胞的侵袭能力。显示侵袭性细胞的典型图像。比例尺=100μm。（E–G）将LINC01134稳定过表达和AKT1S1稳定沉默的HCCLM3细胞脾内注射到裸鼠体内。注射后第28天（E）和尺寸（F）HE染色检测肝转移结节（G）.（H）将荧光素酶标记的LINC01134稳定过度表达和AKT1S1稳定沉默的HCCLM3细胞注射到裸鼠的尾静脉。在注射后第28天，通过检测荧光素酶信号强度来评估肺转移。结果显示为三个独立实验的平均值±SD（A–D）或n个=每组6只小鼠（E–H）. *第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页<0.001，ns，不显著，采用单因素方差分析，然后进行Tukey多重比较测试（A–D）或Kruskal–Wallis检验，然后是Dunn的多重比较检验（东、西、西）.
图7
图7
LINC01134增强NF-κB转录活性。（A）将野生型或互补区突变的LINC01134过表达质粒与含有NF-κB结合位点的萤火虫荧光素酶报告子（pNFκB-luc）和pRL-TK瞬时联合转染到HCCLM3细胞后，进行双荧光素酶酶报告子分析以评估NF-κ的转录活性。结果显示为萤火虫荧光素酶活性与肾盂荧光素酶活性的相对比率。（B）将含有NF-κB结合位点（pNFκB-luc）和pRL-TK的萤火虫荧光素酶报告子与LINC01134特异性shRNAs瞬时共转染到HCCLM3细胞后，进行双荧光素酶报告子分析以评估NF-κ的B转录活性。结果显示为萤火虫荧光素酶活性与肾盂荧光素酶活性的相对比率。（C）将野生型或互补区突变的LINC01134过表达质粒瞬时转染到HCCLM3细胞后，使用NF-κB p65转录因子检测试剂盒检测p65-DNA结合活性。（D）将LINC01134特异性shRNAs瞬时转染到HCCLM3细胞后，使用NF-κB p65转录因子检测试剂盒检测p65-DNA结合活性。（E）用5μM JSH-23处理稳定过度表达的LINC01134和对照SK-HEP-1和HCCLM3细胞。然后，通过Transwell迁移分析来评估处理后的细胞的迁移能力。显示了迁移细胞的典型图像。比例尺=100μm。（F）用5μM JSH-23处理稳定过度表达的LINC01134和对照SK-HEP-1和HCCLM3细胞。然后，通过Transwell侵袭实验评估处理细胞的侵袭能力。显示了侵袭细胞的代表性图像。比例尺=100μm。结果显示为三个独立实验的平均值±SD**第页< 0.01, ***第页<0.001，ns，不显著，采用单因素方差分析，然后进行Dunnett的多重比较测试（A–D）或单向方差分析，然后是Tukey的多重比较测试（E、F）.
图8
图8
LINC01134通过激活AKT1S1-NF-κB信号促进肝癌转移的示意模型。
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