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.2020年6月23日：11:907。
doi:10.3389/fimmu.2020.00907。 eCollection 2020。

MicroRNA-200a通过阻断EZH2介导的STAT3甲基化抑制炎症和动脉粥样硬化病变的形成

王金鹏 1, 李萍 2, 徐晓飞 三, 张蓓琳 4, 张静（音译） 1
附属公司

MicroRNA-200a通过阻断EZH2介导的STAT3甲基化抑制炎症和动脉粥样硬化病变的形成

王金鹏等。 前部免疫. .

摘要

内皮炎症和功能障碍对动脉粥样硬化过程至关重要。新的证据表明，上调miR-200a可降低VCAM-1的表达，并防止单核细胞粘附到主动脉内皮上。然而，关于microRNA-200a（miR-200a）在促进动脉粥样硬化病变形成中的作用的信息有限。我们研究了miR-200a的抗炎和抗动脉粥样硬化作用。在氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）存在下培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs），并用CCK-8分析和流式细胞仪分析评估其活性和凋亡。在miR-200a存在的情况下，通过双荧光素酶报告基因测定来评估齐斯特同源物2（EZH2）启动子活性的增强剂。通过ChIP和IP分析验证了EZH2介导的信号转导子和转录激活子3（STAT3）甲基化。阿波（ApoE）-/-小鼠被给予12周的高脂肪饮食，发育成体内动脉粥样硬化模型。在ox-LDL处理的HUVEC和动脉粥样硬化小鼠模型的主动脉组织中，miR-200a下调，而EZH2和HMGB1上调。miR-200a升高可以保护HUVEC免受ox-LDL诱导的凋亡和炎症的影响。EZH2被证实为miR-200a的靶点。miR-200a的保护作用在EZH2升高时被消除。EZH2甲基化STAT3并通过增加STAT3的酪氨酸磷酸化增强STAT3活性，从而增加ox-LDL处理的HUVEC中的凋亡和促炎细胞因子的释放。在动脉粥样硬化小鼠模型中也证明了miR-200a的抗动脉粥样硬化作用。我们的研究表明，miR-200a具有依赖于EZH2/STAT3信号级联的抗炎和抗动脉粥样硬化活性。

关键词：EZH2；STAT3；动脉粥样硬化；炎症；microRNA-200a。

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数字

图1
图1
miR-200a在ox-LDL诱导的HUVEC中下调。（A）用RT-qPCR测定24小时用0、20和40μg/ml ox-LDL处理的HUVEC中miR-200a的表达，归一化为U6。（B）在0、24和48小时用20μg/ml ox-LDL处理的HUVEC中miR-200a的表达用RT-qPCR测定，归一化为U6*（相对于未经处理的HUVEC）表明第页<0.05（单向方差分析/Tukey's）事后的，事后的测试。
图2
图2
MiRNA-200a保护HUVEC免受ox-LDL诱导的凋亡和炎症。HUVEC用ox-LDL培养或用外源性miR-200a模拟物处理（以NC模拟物为对照）。（A）使用RT-qPCR测定HUVEC中miR-200a的表达水平，并归一化为U6。（B）用ROS检测试剂盒测定HUVEC中的ROS水平。（C）用ROS检测试剂盒测定HUVEC中的MDA水平。（D）CCK-8法检测HUVEC的细胞活力。（E）流式细胞术检测人脐静脉内皮细胞凋亡。（F）通过Western blot分析测定的HUVEC中裂解caspase3和裂解PARP的蛋白质水平，归一化为β-肌动蛋白。（G–I）ELISA法测定HUVEC培养上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度*（相对于未经处理的HUVEC）和#（相对于ox-LDL-处理的HUVEC）表明第页<0.05（单向方差分析/Tukey's）事后的，事后的测试。
图3
图3
miR-200a靶向HUVEC中的EZH2并下调其表达。（A）利用TransmiR数据库预测与miR-200a相互作用的相互作用转录因子(http://www.cuilab.cn/transmir).（B）维恩图(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)TransmiR预测结果与StarBase数据库的交集(网址：http://starbase.sysu.edu.cn/)和miRTarase数据库(http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php).（C）miR-200a EZH2 3′-UTR的结合位点。（D）用双核糖核酸酶报告基因分析检测HUVEC中miR-200a和EZH2的靶向关系。（E）ApoE动脉组织中miR-200a与EZH2的靶向关系−/−用双核糖核酸酶报告基因检测小鼠。用外源性miR-200a模拟物（以NC模拟物作为对照）处理HUVEC。（F）通过RT-qPCR测定HUVEC中EZH2 mRNA水平，并将其归一化为GAPDH。（G）通过Western blot分析测定HUVEC中的EZH2蛋白水平，归一化为β-肌动蛋白。用0、20和40μg/ml ox-LDL处理HUVEC 24小时。（H）RT-qPCR检测HUVEC中EZH2 mRNA水平。用0、20和40μg/ml ox-LDL处理HUVEC 24小时。（一）用RT-qPCR测定用20μg/ml ox-LDL处理0、24和48小时的HUVEC中EZH2 mRNA的水平。（J）通过Western blot分析测定HUVEC中的EZH2蛋白水平，归一化为β-肌动蛋白。用0、20和40μg/ml ox-LDL处理HUVEC 24小时，用20μg/ml的ox-LDL0、24和48小时。*表明第页与未经治疗的HUVEC或空载体治疗的HOVEC相比，<0.05。未配对t吨-测试用于比较两组数据和单向方差分析/Tukey’s事后的，事后的测试以比较多个组的数据。
图4
图4
沉默EZH2对HUVEC产生保护作用，对抗ox-LDL诱导的损伤，类似于miRNA-200a上调。用靶向EZH2-1和EZH2-2的siRNA处理HUVEC（以si-NC为对照）。（A）RT-qPCR测定EZH2对HUVEC的干扰效率。用靶向EZH2的siRNA（以si-NC为对照）和外源性miR-200a模拟物处理HUVEC，并用含EZH2的表达载体（以miR-200a-模拟物+oe-NC为对照）。（B）使用RT-qPCR测定HUVEC中EZH2的表达，并将其归一化为GAPDH。（C）使用Western blot分析测定HUVEC中EZH2的表达，归一化为β-肌动蛋白。（D）用ROS检测试剂盒测量HUVEC中的ROS水平。（E）用ROS分析试剂盒测量HUVEC中的MDA水平。（F）流式细胞术检测HUVEC凋亡。（G）通过Western blot分析测定的HUVEC中裂解caspase3和裂解PARP的蛋白质水平，归一化为β-肌动蛋白。（H）通过CCK-8测定法检测HUVECs的细胞活力。（I–K）ELISA法测定HUVEC培养上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度*（相对于加扰siRNA-处理的HUVEC）和#（相对于miR-200a-mimic+oe–NC）表示第页<0.05（单向方差分析/Tukey's）事后的，事后的测试。
图5
图5
EZH2甲基化STAT3并激活ox-LDL诱导的HUVEC中的p-STAT3/HMGB1。（A）EZH2可以针对使用基于网络的生物信息学资源hTFtarget预测的STAT3(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTF目标#!/). 用0、20和40μg/ml ox-LDL处理HUVEC。（B）用Western blot分析测定0、24和48小时HUVEC中p-STAT3/STAT3的蛋白水平，并将其归一化为β-肌动蛋白。用靶向EZH2的siRNA处理HUVECs。（C）IP法检测HUVEC中EZH2和STAT3的相互作用。（D）ChIP检测HUVEC STAT3启动子区EZH2的富集。（E）IP法检测EZH2对HUVEC STAT3甲基化的影响。（F）用Western blot分析测定HUVEC中p-STAT3/STAT3的蛋白水平，归一化为β-肌动蛋白，用ELISA测定HMGB1浓度。（G）使用ELISA测定HUVEC中24小时HMGB1浓度。用0、20和40μg/ml ox-LDL处理HUVEC 24小时。（H）使用ELISA测定HUVEC中HMGB1的浓度。用20μg/ml ox-LDL处理HUVEC 0、24和48小时。*（相对于IgG或未处理的HUVECs）和#（相对于加扰siRNA-处理的HUVEC）表明第页<0.05（单向方差分析/Tukey's）事后的，事后的测试。
图6
图6
EZH2介导的STAT3甲基化通过激活p-STAT3/HMGB1增强ox-LDL诱导的HUVEC损伤。（A）ELISA法测定HMGB1对HUVEC的干扰效率。用靶向HMGB1的siRNA（以si-NC为对照）或靶向EZH2的siRNA和含HMGB1表达载体（以si-EZH2+oe-NC为对照）处理HUVEC。（B）使用蛋白质印迹分析测定HUVECs中p-STAT3/STAT3的蛋白质水平，标准化为β-肌动蛋白，并通过ELISA测定HMGB1水平。（C）用ROS检测试剂盒测量HUVEC中的ROS水平。（D）用ROS检测试剂盒测量HUVEC中的MDA水平。（E）CCK-8法检测HUVEC的细胞活力。（F）流式细胞术检测HUVEC凋亡。（G）通过Western blot分析测定的HUVEC中裂解caspase3和裂解PARP的蛋白质水平，归一化为β-肌动蛋白。（H–J）ELISA法测定HUVEC培养上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度*（相对于干扰siRNA处理的HUVECs）和#（相对于siRNA-靶向EZH2-治疗的HUVEC）表明第页<0.05（单向方差分析/Tukey's）事后的，事后的测试。
图7
图7
miR-200a在动脉粥样硬化小鼠中的抗动脉粥样硬化作用。阿波（ApoE）−/−用高脂肪饮食喂养小鼠（以ND+NC作为对照）并注射miR-200a agomir（以HFD+NC作为对照）。（A）ApoE动脉组织中miR-200a的表达（归一化为U6）−/−老鼠(n个=10）使用RT-qPCR测定。（B）载脂蛋白E动脉组织油红O染色图像−/−老鼠。（C）油红O染色检测主动脉总病变。（D）载脂蛋白E动脉组织的脂质沉积−/−小鼠油红O染色（×100），红色表示脂质丰富斑块。（E）ApoE动脉组织中的动脉粥样硬化病变−/−HE染色检测小鼠（×100；×400）。（F–H）载脂蛋白E血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度−/−用ELISA法测定小鼠。（一）ApoE动脉组织中EZH2、p-STAT3、STAT3和HMGB1的表达水平−/−小鼠免疫组化染色（×400）*（相对于正常饮食治疗小鼠）和#（相对于高脂肪饮食治疗小鼠）表明第页<0.05（单向方差分析/Tukey's）事后的，事后的测试。
图8
图8
miR-200a参与动脉粥样硬化的调节机制示意图。miR-200a的过度表达通过抑制STAT3的甲基化和激活来抑制细胞损伤、凋亡和炎症反应，从而抑制动脉粥样硬化的进展，从而抑制EZH2和HMGB1的表达。
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