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.2020年8月20日；48(14):7834-7843.
doi:10.1093/nar/gkaa559。

RADX浓缩单链DNA以对抗RAD51负载

张洪山 1, 杰弗里·M·绍布 1, 伊利亚·芬克尔斯坦 1 2
附属公司

RADX浓缩单链DNA以对抗RAD51负载

张洪山等。 核酸研究. .

摘要

RADX是一种哺乳动物单链DNA结合蛋白，可稳定端粒和停滞的复制叉。细胞生物学研究表明，RADX和复制蛋白A（RPA）之间的平衡对DNA复制完整性至关重要。RADX也是RAD51介导的停滞分叉处同源重组的负调控因子。然而，RADX作用于DNA的机制及其与RPA和RAD51的相互作用仍然是个谜。使用体外关键蛋白质的单分子成像，我们发现RADX浓缩ssDNA细丝，即使ssDNA以生理蛋白质比率被RPA包裹。RADX通过能够捕获反式ssDNA的高阶组装体将RPA涂层的ssDNA细丝压实。此外，RADX通过RAD51阻止RPA位移，并防止RAD51加载到ssDNA上。我们的结果表明，RADX是一种ssDNA缩合蛋白，可以抑制RAD51丝的形成，并可能拮抗RPA涂层ssDNA上的其他ssDNA-结合蛋白。

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数字

图1。
图1。
RADX浓缩单链DNA。(A类)假定的RADX域组织有三个OB-folds。(B类)单链ssDNA帘分析的图示。(C类)卡通插图（顶部）和一个典型的波形图显示，0.1 nM RADX可以快速结合和压缩ssDNA。通过荧光标记的ssDNA末端（绿色）的移动来监测压实的程度和速度。ssDNA结合后，RADX被反标记-ATTO647N（洋红色）可视化。水平线指示何时注射RADX和anti-Flag-ATTO647N。(天)RADX诱导ssDNA压实百分比的量化。(E类)RADX诱导ssDNA压实率的量化。小提琴图：开圆圈表示中间值，垂直线表示每个分布的95%分位数。每个条件下至少测量了25个ssDNA分子。纳秒，P（P）> 0.05.
图2。
图2。
RADX浓缩RPA包被的ssDNA。(A类)插图（顶部）和2nM RADX浓缩的RPA-GFP包被的ssDNA的代表性描记图。在添加RADX之前，将RPA-GFP注入流动池。(B类)RADX诱导的RPA–ssDNA压实的量化。每种情况下至少分析了22个ssDNA分子。纳秒，P（P）> 0.05, *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001****P（P）< 0.0001. (C类)RPA-GFP和RADX摩尔比为1:1、10:1和100:1（2:2、20:2和200:2 nM RPA-GFP:RADX）时ssDNA压实的Kymograph。在添加RPA-GFP和RADX的混合物之前，将RPA-GFP注入流动池。注射200 nM RPA–GFP产生强烈的背景绿色荧光信号，直到蛋白质离开流动细胞（底部面板）。(天)不同RPA与RADX摩尔比下RADX诱导的ssDNA压实的定量(C类). 每个条件下至少分析25个ssDNA分子。
图3。
图3。
RADX通过蛋白质相互作用连接ssDNA。(A类)双链ssDNA帘幕分析的图示。ssDNA由RPA包被，并固定在脂质双层上方的两个铬特征之间。(B类)左图：RADX在RPA涂层的ssDNA上形成大序列组合，通过2 nM Flag-RADX（绿色）和2 nM MBP-RADX（洋红色）的自结合成像。右图：一个分子的Kymograph（橙色方框）表明MBP-RADX病灶优先在Flag-RADX位点形成。Flag-RADX用抗Flag-Alexa488标记，MBP-RADX用抗MBP-QD705抗体可视化。(C类)MBP-RADX和Flag-RADX共同定位频率的量化（从113个ssDNA分子中收集）。(天)kymograph显示RADX直接捕获RPA涂层ssDNA帘幕上的非互补ssDNA寡核苷酸。箭头指示RADX和oligo共同定位的位置。(E类)RADX和寡核苷酸共定位频率的量化（从89个ssDNA分子中收集）。(F类)一个波形图表明RADX与非互补ssDNA寡核苷酸预孵育后能有效结合在RPA涂层的ssDNA幕上。注入流动池的RADX和寡聚物的浓度分别为2和1 nM。黄线：将缓冲液流切换为ON和OFF表示寡核苷酸稳定地结合在ssDNA上。
图4。
图4。
RADX保护RPA不受RAD51位移的影响，以抑制RAD51灯丝伸长。(A类)1μM RAD51结合和延伸裸（顶部）或RPA涂层（底部）ssDNA的Kymograph。(B类)RAD51加载后ssDNA长度变化的量化（裸实验和RPA涂层实验分别至少27个ssDNA分子）。(C类)Kymograph显示1μM RAD51无法取代RADX并延伸ssDNA或RPA–ssDNA。在这些实验中使用了2 nM RADX。(天)RAD51添加到流动池后，定量RADX压缩的ssDNA或RPA-ssDNA长度（裸实验和RPA-涂层实验分别至少21个ssDNA分子）。(E类)RADX（洋红色，N个=45），RADX和RAD51（黑色，N个=56），或仅RAD51（蓝色，N个=40）。(F类)RADX阻断RAD51从双链单链DNA中置换RPA。红色框表示RPA与RADX共同定位的区域。灰色框表示没有RADX的RPA段。实验中使用了2 nM RPA、2 nM RADX和1μM RAD51。(G公司)RAD51（黑色，N个=65），在RAD51（红色，N个=53），如果没有RADX和RAD51（蓝色，N个= 50).
图5。
图5。
RADX如何对抗RAD51的建议模型。RADX可压缩RPA–ssDNA细丝，抑制RPA移位和RAD51细丝形成。RADX还通过未知机制从ssDNA中删除RAD51。
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