跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息,确保你在联邦政府政府网站。

HTTP服务器

该站点是安全的。
这个https(https)://确保您连接到官方网站,并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2020年10月;26(10):1414-1430。
doi:10.1261/rna.076430.120。 Epub 2020年6月10日。

消除校准1CRISPR-Cas9基因编辑的长3'-UTR mRNA亚型损伤小鼠背根神经节发育和海马神经元激活

附属公司

消除校准1CRISPR-Cas9基因编辑的长3'-UTR mRNA亚型损伤小鼠背根神经节发育和海马神经元激活

Bongmin Bae公司等。 核糖核酸. 2020年10月.

摘要

大多数小鼠和人类基因受到选择性切割和多聚腺苷酸化(APA)的影响,这通常导致两种或多种选择性长度3'非翻译区(3'-UTR)mRNA亚型的表达。在神经组织中,APA亚型的表达在全球范围内增强,3'-UTR更长,但这些替代3'-UTR亚型的生理相关性尚不清楚。钙调蛋白1(校准1)是钙信号的关键集成商,产生短(校准1-S)和long(校准1-L)通过APA的3'-UTR mRNA亚型。我们发现校准1-L表达主要局限于小鼠的神经组织,包括背根神经节(DRG)和海马,而校准1-S更广泛地表达。smFISH透露校准1-S校准1-L定位于初级海马神经元的神经突起。相反,培养的DRG表现出对校准1-L去索马里。研究校准1-L,我们实施了CRISPR-Cas9基因编辑策略,删除包含校准1远端poly(A)位点。这消除了校准1-L表达式,同时保持表达式校准1-S缺少老鼠校准1-L(校准1ΔL/ΔL)在胚胎中表现出无组织的DRG迁移,并且在成年海马中经历诱导的神经元激活减少。这些数据表明校准1-L在中枢和外周神经系统中发挥功能作用。

关键词:3′-UTR;交替聚腺苷化;轴突;钙调素;背根神经节;海马;mRNA定位。

PubMed免责声明

数字

图1。
图1。
校准1-L神经元表达丰富。(A类)显示northern blot和DIG原位探针检测两种亚型(uni)或特别是长3′-UTR亚型(ext)的图表。(B类)用uni探针对成年小鼠收集的一系列组织进行Northern杂交,结果显示校准1-S(底部箭头)和校准1-L(顶部箭头)。比率校准1-L归一化为总计校准1(总计校准1-S波段强度和校准1-L)如图所示。(C类)用ext-probe进行Northern杂交。相同的印迹被剥离并重新复制用于看家基因磅/平方米4作为负载控制。(D类)用单探针对E13.5胚胎和8w大脑进行DIG原位杂交,结果显示校准1在前脑(FB)、中脑(MB)、后脑(HB)、脊髓(SC)、背根神经节(DRG)、皮层和海马(Hpc)等神经系统显示强信号。(E类)用ext探针原位DIG显示神经组织特异性表达模式校准1-LDRG和Hpc中的信号特别强。(F类)可以看到纯化神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞、新形成的少突胶质细胞和内皮细胞的RNA-seq轨迹。校准1-L基因模型显示为注释和校准1-S根据测序读取覆盖率对基因模型进行了说明。长3′-UTR的阅读覆盖率在神经元中尤其高。(G公司)QAPA用于估计校准1-S校准1-L在每个RNA-seq数据集中找到。poly(A)的用法表明卡尔m1-L确实富含神经元。每种细胞类型重复两次。(H(H))显示RNAscope smFISH探针位置的图表。(一、 J型)总共执行了smFISH校准1(uni)或校准1-L(ext)原代DRG培养物中的转录物与β3 Tubulin(Tubb3)神经元标记物共标记。大多数细胞显示出强大的单一信号,而外显信号在Tubb3阳性细胞中受到限制。显著性使用t吨-测试,(****)P(P)< =0.0001.n个=58个Tubb3-pos电池,n个=23个Tubb3-阴性细胞。(K(K),L(左))smFISH在原代海马培养中表现出相同的趋势。显著性使用t吨-测试,(****)P(P)< =0.0001.n个=17个Tubb3-pos细胞,n个=9个Tubb3-阴性细胞。
图2。
图2。
亚细胞定位校准1-L. (A类)显示RNAscope smFISH探针位置的图表。合并uni和ext图像时,校准1-L异构体显示为共定位(白色)斑点。(B类)smFISH显示了强健的轴突定位校准1-S(uni),但校准1-L(扩展/洋红色输入B类'或白色平底船B类〃)在DRG轴突中观察到。(C类)当计算轴突uni或extpuncta的数量时,在DRG神经元的轴突中强烈地发现uni信号,但在相同的区域几乎没有发现ext信号。显著性使用t吨-测试,(****)P(P)< =0.0001.n个=30个神经元。(D类)在初级海马神经元中校准1-S校准1-L在体细胞和神经元突起中观察到。(E类)对应的punta数校准1-S校准1-L海马突起的转录本没有发现显著差异。显著性使用t吨-测试,ns:P(P)> 0.05.n个=15个神经元。(F类)分析所有校准1-S卡尔m1-L信号显示两种mRNA亚型的总体分布不同。分析完成于n个=15个神经元(校准1-L684点,校准1-S907点)。显著性通过Wilcoxon检验确定,(***)P(P)<=0.001。
图3。
图3。
生成校准1使用CRISPR–Cas9的长3′-UTR缺失小鼠。(A类)用于消除成熟long生产的策略示意图校准13′-UTR转录本。同时注射6个gRNAs(g1–g6)以产生各种缺失(缺失1–3)。(B类)校准1三个缺失菌株和对照同窝雌鼠成年皮层的northern印迹显示long基因的成功缺失校准13′-UTR亚型。注意,由于保留了远端PAS,删除2行产生了一个新的亚型,其长3′-UTR被截断。来自校准2校准m3发现基因没有改变。磅/平方米4用作加载控件。(C类)完全失去校准1-L在中校准1ΔL/ΔL(缺失3)海马神经元已被缺乏的smFISH信号所证实,这些信号代表校准1-L. (D类)原位DIG在校准1ΔL/ΔL(删除3)胚胎也没有表达校准1-L.
图4。
图4。
校准1ΔL/ΔL小鼠表现出DRG轴突发育缺陷。发展中的C1 DRG显示轴突和细胞体迁移紊乱校准1ΔL/ΔLE10.5胚胎。(A类)的示意图校准1+/+E10.5胚胎突出C1和C2 DRG轴突和细胞体的形态。(B类,C类)整个底座校准1+/+校准1ΔL/ΔL通过抗Tubb3标记可视化DRG形态。(B类)中C1 DRG(箭头)的胞体校准1+/+胚胎被捆绑在一起形成一个独特的神经节。可以看到C2 DRG的神经突起在有组织的束中向腹侧突出。(C类)中的C1 DRG校准1ΔL/ΔL动物是无组织的,由延伸成束的轴突(箭头)的细胞体簇(箭头)组成。缺失动物的C1 DRG细胞相对于校准1+/+与西北地区相邻(B类′,C类′). 同一Z堆叠的单个光学部分的放大视图B类C类聚焦于神经节细胞体形态紊乱的突变体,相对于对照组,其异常迁移更多的吻侧。(D类F类)为了在胚胎之间的相同相对位置开始测量,将n.xii用作解剖地标,以设置测量的开始,用灰色虚线表示B类″,C类″. (D类)为发育DRG而观察到的异位细胞体面积的量化。(E类)细胞异常聚集体的距离校准1+/+校准1ΔL/ΔL. (F类)C1神经节外投射轴突束数量的量化。重要性由t吨-测试;n个=4 C1图纸校准1+/+;n个=5 C1图纸校准1ΔL/ΔL.n.xi=副神经,n.xii=舌下神经。(G公司)毛细管western分析校准1+/+校准1ΔL/ΔL胚胎DRG总体蛋白水平无变化。显著性使用t吨-测试,P(P)= 0.802;n个= 3.
图5。
图5。
的特征校准1海马体中的异构体。(A类)qRT-PCR分析显示总体无变化校准1(uni)之间的RNA水平校准1+/+校准1ΔL/ΔL,而校准1-L表达在年被废除校准1ΔL/ΔL海马体。使用t吨-测试,ns:P(P)> 0.05, (**)P(P)< =0.01,n个=4只小鼠。(B类)蛋白质印迹分析校准1+/+校准1ΔL/ΔL成年海马体的总体蛋白质水平没有变化。显著性使用t吨-测试,P(P)= 0.287;n个=3只小鼠。(C类,D类)两者的smFISH分析校准1+/+校准1ΔL/ΔL海马神经元显示校准1-L没有明显损害校准1海马神经元中的mRNA。采用Wilcoxon检验确定显著性,ns:P(P)> 0.05;n个= 19校准1+/+神经元(739点),n个= 26校准1ΔL/ΔL神经元(802个点)。
图6。
图6。
校准1-L随着环境暴露的增加,海马IEG表达减少。(A类)本研究中使用的富集环境和CA1区域的图解B类. (B类)显示EE诱导的cFos在校准1+/+校准1ΔL/ΔLCA1(C类)FIJI/ImageJ对整个CA1区cFos阳性细胞的百分比进行了量化。显著性使用t吨-测试,(***)P(P)< =0.001.n个=6只小鼠(每只小鼠在两个大脑切片中有两个半球)。(D类)总行驶距离、平均速度、在周边和勘探区域花费的时间水平校准1+/+校准1ΔL/ΔL采用旷野试验对小鼠进行比较。显著性使用t吨-在中测试n个=5只小鼠;纳秒:P(P)> 0.05.

类似文章

引用人

工具书类

    1. Alwis DS,Rajan R.2014年。环境富集与感觉脑:富集在脑损伤修复中的作用。前系统神经科学8:156 10.3389/fnsys.2014.00156-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. An JJ、Gharami K、Liao G-Y、Woo NH、Lau AG、Vanevski F、Torre ER、Jones KR、Feng Y、Lu B等,2008年。长3′UTR BDNF mRNA在海马神经元脊柱形态和突触可塑性中的独特作用。手机134:175–187。2016年10月10日/j.cell.2008.05.045-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Andreassi C、Zimmermann C、Mitter R、Fusco S、Devita S、Saiardi A、Riccio A,2010年。NGF反应元件将肌醇单磷酸酶1 mRNA靶向交感神经元轴突。《国家神经科学》13:291–301。10.1038/nn.2486-内政部-公共医学
    1. Bellaousov S、Reuter JS、Seetin MG、Mathews DH。2013.RNA结构:用于RNA二级结构预测和分析的网络服务器。核酸研究41:W471–W474。10.1093/nar/gkt290-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Blair JD、Hockemeyer D、Doudna JA、Bateup HS、Floor SN.2017年。人类神经元分化过程中广泛的平移重构。细胞代表21:2005–2016。2016年10月10日/j.celrep.2017.10.095-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型