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.2020年5月15日；10(14):6182-6200.
doi:10.7150/thno.46553。 eCollection 2020。

点燃素-2缺乏导致小鼠致命性肠梗阻

何晓坤 1, 宋嘉贵 1, 蔡泽宇 2, 池晓春 1, 王振斌 1, Deco Yang公司 1, 谢思安（Sian Xie） 2, 荆州 2, 易孚 2, 魏丽 三, 魏刚（Wei Kong） 2, Jun Zhan先生 1, 张洪泉 1
附属公司

点燃素-2缺乏导致小鼠致命性肠梗阻

何晓坤等。 治疗诊断科技. .

摘要

理论基础：平滑肌运动障碍主要表现为收缩力受损和功能性肠梗阻。其中一些病例是由平滑肌基因ACTA2、ACTG2、MYH11、MYLK和LMOD1的基因突变引起的。尽管如此，其病因复杂且多因素，其潜在的病理学尚不清楚。整合素相互作用蛋白Kindlin-2在横纹肌和平滑肌细胞（SMC）中广泛表达。然而，Kindlin-2在平滑肌中的功能仍不明确。方法：我们使用不同的cre启动子转基因小鼠Kindlin-2建立了两个小鼠模型飞行/飞行SM22α-cre+（cKO小鼠）和Kindlin-2飞行/飞行; MYH-cre+（iKO小鼠）。制备胚胎和成人组织进行苏木精-伊红（H&E）染色、免疫组织化学（IHC）和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口标记（TUNEL）凋亡检测。我们使用透射电镜（TEM）观察小鼠平滑肌的超微结构变化，并使用多线肌电图系统（DMT 620M）测量主动脉环和肠环上的平滑肌收缩力。此外，应用细胞牵引力显微镜（CTFM）观察RNAi耗尽Kindlin-2后原代SMC的功能变化。结果胚胎平滑肌中Kindlin-2编码基因Fermt2的耗竭导致细胞凋亡，下调SMC的关键成分，损害平滑肌发育，最终导致胚胎在E14.5死亡。他莫昔芬在成年小鼠平滑肌中诱导的Kindlin-2特异性敲除显示血压降低、肠道蠕动减退，最终死于肠梗阻。在iKO小鼠中，Kindlin-2缺乏还导致Myh11、α-SMA和CNN下调，肌丝缩短，肌原纤维断裂，平滑肌收缩力受损。从机制上讲，Kindlin-2的损失降低了Ca2+通过下调钙结合蛋白S100A14和STIM1的表达在原代血管平滑肌细胞（PVSMC）中的内流。结论：我们证明了Kindlin-2对于维持平滑肌的正常结构和功能至关重要。Kindlin-2的缺失通过诱导细胞凋亡而损害胚胎发育过程中的平滑肌形成，并通过阻断钙离子而危害成年平滑肌的收缩2+导致肠梗阻的肠内流。成年平滑肌中Kindlin-2缺失的小鼠可能是一种有效的肠梗阻动物模型，用于疾病研究、药物治疗和预后。

关键词：肠梗阻；Kindlin-2；平滑肌收缩；平滑肌结构。

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数字

图1
图1
特定敲除Kindlin-2导致的平滑肌损伤导致胚胎死亡。（A） 不同基因型E12.5-15.5胚胎的外观。胚胎用多聚甲醛固定。cKO（Kindlen-2飞行/飞行;SM22α-cre+）胚胎在E14.5时是致命的（箭头）。（B） 整个胚胎切片用苏木精和伊红（HE）染色。给出了具有代表性的图像和形态异常。WT（Kindlin-2飞行/飞行;SM22α-cre-，上面板）和cKO小鼠（Kindlin-2飞行/飞行;SM22α-cre+，下面板）。H： 心脏；五十： 肝脏；GI：胃肠道；P： 胰腺。比例尺，1mm。（C） E12.5-E15.5胚胎动脉的HE染色。比例尺、50μm（D）Western blot分析E12.4-E15.5的全胚胎裂解，分别检测Myh11、α-SMA和CNN的表达水平。（E） （D）和其他两个独立实验的定量。数据表示为平均值±SEM*对经学生t检验<0.05。更多信息请参见图S1、S2、表S1、S2和S3。
图2
图2
Kindlin-2的特异性敲除导致血管和肠道平滑肌细胞凋亡。（A） 动脉中Kindlin-2的E14.5 WT和Kindlin-2cKO胚胎横截面免疫组织化学染色。比例尺，50μm。（B） 肠中Kindlin-2的E13.5 WT和Kindlin-2cKO胚胎切片免疫组织化学染色。比例尺，50μm。（C） 动脉中α-SMA E14.5 WT和Kindlin-2 cKO胚胎横截面的免疫组织化学染色。红色箭头表示核固缩。比例尺，50μm。（D） 肠内α-SMA E13.5 WT和Kindlin-2 cKO胚胎切片的免疫组织化学染色。比例尺，50μm。（E） Kindlin-2表达的定量图S3A和C通过图像J，数据为平均值±SEM*对<0.05时**对<0.01和***对<0.001（按学生）t吨-测试。（F） α-SMA表达的定量图S3B和D通过图像J，数据为平均值±SEM*对< 0.05, **对<0.01和***对<0.001（按学生）t吨-测试。（G） E14.5 WT和Kindlin-2 cKO胚胎横切面的免疫组织化学染色，以检测动脉中裂解的caspase-3。下面显示了高亮区域的放大视图。比例尺，50μm。caspase-3蛋白表达水平的增加表明cKO小鼠与WT同窝小鼠相比发生了凋亡。（H） E13.5 WT和Kindlin-2 cKO胚胎切片的肠内裂解胱天蛋白酶-3的免疫组织化学染色。下面显示了高亮区域的放大视图。比例尺，50μm。（一） E14.5 WT和Kindlin-2 cKO胚胎横截面动脉的代表性免疫荧光照片。切片共染α-SMA和TUNEL。右侧显示了高亮区域的放大视图。比例尺，20μm。（J） E13.5 WT和Kindlin-2 cKO胚胎切片肠的代表性免疫荧光照片。切片共染α-SMA和TUNEL。比例尺，20μm。右侧显示了高亮区域的放大视图。有关更多信息，请参见图S3。
图3
图3
成人平滑肌中Kindlin-2的特异性敲除导致个体因肠梗阻死亡。（A） Kindlin-2基于体重的增长曲线飞行/飞行;MYH cre-（WT）和Kindlin-2飞行/飞行;注射三苯氧胺后的MYH-cre+小鼠（n=4）*对< 0.05, **对< 0.01, ***对< 0.001. （B） 注射三苯氧胺4周后的食物摄入量和粪便排泄量（每组4例）*对< 0.05, **对< 0.01. （C） WT和成年iKO小鼠的全肠道转运时间（n=4）***对< 0.001. （D） WT和iKO小鼠的收缩压曲线，在第1天注射三苯氧胺，n=4*对<0.05（E）WT和iKO小鼠的舒张压曲线，第1天注射他莫昔芬，n=4*对< 0.05. （F） WT（n=11）与iKO同窝伙伴（n=10）的Kaplan-Meier生存图。小鼠在6-8周时接受三苯氧胺治疗，1天后开始绘图。所有iKO小鼠都出现了巨大的结肠样梗阻，并在40天之前死亡，而对照组小鼠生长正常。对=0.0006。（G） 尸检时WT和iKO小鼠结肠的左腹视图，三苯氧胺治疗5周后，iKO鼠表现出巨大的结肠样表型（白色箭头）。HE染色后，中肠瑞士卷。比例尺，3mm（第二列），100μm（第三和第四列）。（H） 三种对照小鼠Kindlin-2、平滑肌标志物Myh11、CNN和结肠肌动蛋白表达的Western blot分析飞行/飞行;MYH-cre-、Kindlin-2重量/重量; MYH-cre+小鼠接受三苯氧胺注射和Kindlin-2飞行/飞行;注射玉米油的MYH-cre+，在休息4周后收获结肠，没有发现显著差异。（一） Western blot分析WT、Kindlin-2、平滑肌标志物Myh11、CNN和结肠肌动蛋白表达液体/重量;MYH cre+和iKO小鼠。三苯氧胺治疗4周后。（J） 图I的定量*对< 0.05, **对< 0.01, ***对< 0.001. 有关更多信息，请参见图S4。
图4
图4
成人平滑肌中Kindlin-2的耗竭导致细胞凋亡。（A） 主动脉横切面（左）和结肠（右）的Kindlin-2、α-SMA、裂解caspase-3免疫组化染色。WT和iKO小鼠并行注射三苯氧胺，14天后切除升主动脉和乙状结肠并固定。比例尺，100μm。（B） 上升主动脉（上）和乙状结肠（下）横截面上TUNEL（红色）、DAPI（蓝色）和α-SMA（绿色）的免疫荧光。右侧显示了高亮区域的放大视图。比例尺，20µm。有关更多信息，请参见图S5。
图5
图5
iKO小鼠出现SMC超微结构损伤。（A） 主动脉平滑肌的透射电镜（TEM）图像。WT和iKO小鼠并行注射三苯氧胺，注射后14天切除升主动脉并固定。白色方框指出细胞核，显示iKO SMC核固缩。纵向平滑肌丝长度，WT组：13.96±3.22μm（左上），iKO组：2.71±0.57μm（右上）。对< 0.001; 上面板：刻度条，2μm，中刻度条，刻度条下1μm，200nm。（B） 结肠平滑肌的透射电子显微镜（TEM）图像。WT和iKO小鼠并行注射他莫昔芬，并在注射后14天切除和固定乙状结肠。白色箭头：液泡。平滑肌直径为52.76±0.95μm（左上：WT组）vs.37.48±2.56μm（右上：iKO组）。对< 0.01; 上面板：标尺，5μm，标尺下，1μm。
图6
图6
Kindlin-2的缺失损害了成年平滑肌的收缩功能。（A） 苯肾上腺素（Phe-）诱导的WT和KO小鼠主动脉环收缩的累积浓度响应曲线（从3nM到10μM）。小鼠在实验前8周注射三苯氧胺，休息2周。数据表示为平均值±SEM（n=6）**对通过学生t检验，<0.01。（B） 乙酰胆碱（ACh-）诱导的WT和iKO小鼠主动脉环舒张的累积浓度响应曲线（从3nM到10μM）。数据表示为平均值±SEM（n=6）。（C） 苯丙氨酸诱导WT和iKO小鼠主动脉环收缩的累积浓度响应曲线（从3nM到10μM）。苯丙氨酸诱导收缩前，用100μM L-NAME培养环。数据表示为平均值±SEM（n=6）**对经学生t检验<0.01。（D） SNP诱导的WT和iKO小鼠主动脉环舒张的累积浓度响应曲线（从3nM到10μM）。苯丙氨酸诱导收缩前，用100μM L-NAME培养环。数据表示为平均值±SEM（n=6）。（E） Phe和Ach诱导WT和iKO小鼠空肠收缩的累积浓度响应曲线（Phe：从3nM到10μm，Ach：从100nM到300μm）。数据表示为平均值±SEM（n=4）*对< 0.05, **对<0.01和***对经学生t检验<0.001。（F） Phe和Ach诱导的WT和iKO小鼠回肠收缩的累积浓度响应曲线（Phe：从3nM到10μm，Ach：从100nM到300μm）。数据表示为平均值±SEM（n=4）*对<0.05时**对<0.01和***对经学生t检验<0.001。（G） 细胞牵引力显微镜（CTFM）实验的示意图描绘了被粘附细胞变形的弹性基底。细胞与胰蛋白酶分离，以监测位移场。（H） 使用CTFM的PVSMC牵引力。牵引力图采用彩色编码，红色表示最大力，蓝色表示最小力。（一） （H）中最大牵引力的定量。数据表示为平均值±SEM（n=5）*对经学生t检验<0.05。
图7
图7
Kindlin-2耗竭下调钙结合蛋白和SOCE信号。（A） 用血管紧张素刺激预载fluo3-AM的细胞，并在共焦显微镜下进行检查。每20秒采集一次连续荧光图像。显示了一些具有代表性的图像（在刺激后50秒拍摄）。比例尺，20μm。（B） 相对fluo3-AM荧光值计算为ΔF/F0，以表示相对Ca2+水平。（C） KEGG分析了iKO组比WT对照组中20条最上调的已识别基因路径。（D） KEGG分析了iKO组与WT对照组相比11条最下调的已识别基因通路。（E） 与KEGG平滑肌收缩途径相关的已确定基因的热图（>2倍变化）。横坐标表示实验样品；纵坐标表示差异基因。（F） 平滑肌收缩相关基因的相对mRNA水平。用阴性对照（NC）或Kindlin-2 siRNA转染PVSMC，在Kindlin-2siRNA干扰72h后分离总RNA*对< 0.05**对< 0.01***对<0.001. （G） Kindlin-2siRNA干扰后72h PVSMC的Western blot分析。（H） 三苯氧胺治疗4周后WT和iKO小鼠结肠相关蛋白表达的Western blot分析。有关更多信息，请参见图S6。
图8
图8
Kindlin-2耗尽导致肠梗阻的工作模型。Kindlin-2的缺失导致平滑肌细胞凋亡，使平滑肌细胞数量大大减少。Kindlin-2缺失导致平滑肌结构蛋白和钙的丢失2+通道蛋白，破坏现有平滑肌细胞的结构和收缩功能。结果，胃肠道壁变薄，蠕动能力下降，管腔扩张，最终导致肠梗阻。
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