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.2020年5月30日26:e921894。
doi:10.12659/MSM.921894。

水蛭素通过缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）/血管内皮生长因子（VEGF）信号通路降低糖尿病肾病大鼠模型肾小管上皮细胞中细胞外基质标记物的表达

彭欣欣 1, 张亚戈 2, 石秀杰 2, 子宁彭 2, 玉凤星 2, 韩家瑞 2
附属公司

水蛭素通过缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）/血管内皮生长因子（VEGF）信号通路降低糖尿病肾病大鼠模型肾小管上皮细胞胞外基质标记物的表达

彭欣欣等。 医学科学Monit. .

摘要

背景本研究旨在研究水蛭素对糖尿病肾病（DKD）大鼠模型肾小管上皮细胞和HK-2人肾小管内皮细胞产生细胞外基质（ECM）因子的影响。材料与方法Sprague-Dawley大鼠分为正常对照组（n=10）、正常对照+水蛭素组（n=20）、DKD模型组（n/12）和DKD+水蛭素组（n=12）。研究结束时，进行肾脏组织病理学检查，并使用免疫组织化学、Western blot和定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）评估IV型胶原、纤维连接蛋白、低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）的表达。HK-2细胞在葡萄糖中培养并用水蛭素处理。在HIF-1α敲低或过度表达后，评估纤维连接蛋白、IV型胶原、HIF-1 alpha和VEGF的蛋白和mRNA表达。结果水蛭素显著改善DKD大鼠模型肾功能（P<0.01），显著下调纤维连接蛋白、IV型胶原、HIF-1α和VEGF蛋白的表达（P<0.05）。经高糖处理的HK-2细胞中ECM相关蛋白表达增加，而高糖+shRNA HIF-1α组中ECM相关蛋白质表达减少（P<0.05）。与对照组相比，HIF-1α过表达组ECM相关蛋白的表达增加，水蛭素治疗后降低（P<0.05）。结论水蛭素通过抑制DKD肾小管上皮细胞HIF-1α/VEGF信号通路，降低了ECM标记物的表达。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

没有。

数字

图1
图1
糖尿病肾病（DKD）大鼠模型中研究组肾组织组织学变化的显微照片。(A类)苏木精和伊红（H&E）染色显示，与模型组相比，模型+水蛭素组的肾小管、肾小球和系膜基质的组织学变化减少。图中箭头表示系膜基质增生。（放大倍数×400）。(B类)周期性酸性Schiff（PAS）染色显示模型组小管基底膜增厚，近端小管扩张，小管扩张。箭头表示PAS阳性材料的沉积。（放大倍数×400）。(C类)Masson三色染色显示胶原纤维沉积在DKD大鼠模型的肾小球中。水蛭素治疗组可减少肾间质纤维。蓝色物质是胶原纤维的沉积。Ctrl–控制；DKD——糖尿病肾病；H–水蛭素。Ctrl+H–正常对照组+水蛭素组；DKD+H–DKD+水蛭素组。建立DKD大鼠模型后，正常对照组+水蛭素组、DKD+水蛭素组皮下注射水蛭素（1 ATU）。正常对照组和模型组大鼠皮下注射生理盐水（1mg/kg/天）。
图2
图2
(A–D)糖尿病肾病（DKD）大鼠模型肾组织中细胞外基质（ECM）、低氧诱导因子-1α（HIF-1α）和血管内皮生长因子（VEGF）标记物的免疫组织化学研究。ECM相关蛋白的免疫组织化学表达，包括纤维连接蛋白和IV型胶原、低氧诱导因子-1α和血管内皮生长因子（VEGF）。（放大倍数×400）。箭头表示免疫染色阳性。STZ–链脲佐菌素；Ne——阴性；FN–纤维连接蛋白；IV-C–IV型胶原；HIF-1α-低氧诱导因子-1α；VEGF——血管内皮生长因子；Ctrl–控制；DKD——糖尿病肾病；H–水蛭素。Ctrl+H—正常对照+水蛭素组；DKD+H–DKD+水蛭素组。
图3
图3
水蛭素对糖尿病肾病（DKD）大鼠模型中纤维连接蛋白和IV型胶原表达的影响。(A类)Western blot检测IV型胶原和纤维连接蛋白的蛋白表达水平。(B、 C)使用GraphPad Prism 7.0版定量蛋白质表达。β-肌动蛋白作为内部对照。定性评估和计算灰度值。(D、 E类)采用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）评估IV型胶原、纤维连接蛋白的相对mRNA水平。所有数据均表示为平均值±标准偏差（SD）。与正常对照组相比，##P<0.01；#P<0.05。与模型组相比，**P<0.01；*P<0.05。STZ–链脲佐菌素；DKD——糖尿病肾病；H-水蛭素；FN–纤维连接蛋白；IV-C–IV型胶原；HIF-1α–缺氧诱导因子-1α；VEGF–血管内皮生长因子。Ctrl–控制；Ctrl+H——正常对照+水蛭素组；DKD+H–DKD+水蛭素组。
图4
图4
水蛭素对糖尿病肾病（DKD）大鼠模型低氧诱导因子-1α（HIF-1α）/血管内皮生长因子（VEGF）信号通路的影响。(A类)Western blot检测HIF-1α和VEGF的蛋白表达水平。（B、C)使用GraphPad Prism 7.0版定量蛋白质表达。β-actin作为内部对照。通过定性评估和计算灰度值。(D、 E类)采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）评估HIF-1α和VEGF的相对mRNA水平。所有数据均表示为平均值±标准偏差（SD）。与正常对照组相比，##P<0.01；#P<0.05。与模型组相比，**P<0.01；*P<0.05。Ctrl–控制；STZ–链脲佐菌素；DKD——糖尿病肾病；H-水蛭素；FN–纤维连接蛋白；IV-C–IV型胶原；HIF-1α-低氧诱导因子-1α；VEGF——血管内皮生长因子；Ctrl+H–正常对照组+水蛭素组；STZ+H–STZ+水蛭素组。
图5
图5
水蛭素对HK-2细胞增殖的影响。(A类)分别用PBS（对照）、水蛭素（10、20、40、80、160和320μg/mL）处理细胞12、24和48小时。使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞活力。#P<0.05；##P<0.01与。控件。(B类)用PBS（对照）、HG、水蛭素10μg/mL+HG（H+HG）处理细胞12、24和48小时。用CCK-8法测定细胞活力。PBS——磷酸盐缓冲盐水；HG——高糖；H-水蛭素；CCK-8–细胞计数试剂盒-8。与对照组相比，##P<0.01；#P<0.05；与模型组比较，**P<0.01，*P<0.05。PBS——对照组；HG——高糖培养组；HG+H–高糖+水蛭素组。
图6
图6
水蛭素通过抑制缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）/血管内皮生长因子（VEGF）途径，降低高糖诱导的HK-2细胞中纤连蛋白和IV型胶原的表达。HIF-1α基因敲除后IV型胶原和纤维连接蛋白的变化。(A类)采用Western blot检测IV型胶原和纤维连接蛋白的蛋白表达水平。(B、 C)采用定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot检测HIF-1αmRNA和蛋白的相对表达水平。(D、 E类)使用GraphPad Prism 7.0版定量蛋白质表达。β-actin作为内部对照。通过定性评估和计算灰度值。(F、 G公司)使用qRT-PCR评估IV型胶原和纤维连接蛋白的相对mRNA水平。HIF-1α过度表达和水蛭素干预后IV型胶原和纤维连接蛋白表达的变化。(H（H）)采用Western blot检测IV型胶原和纤维连接蛋白的蛋白表达水平。(一、 J型)使用qRT-PCR评估HIF-1α的相对mRNA和蛋白表达水平。(K、 L（左）)GraphPad Prism软件用于蛋白质表达的定量分析。β-actin作为内部对照。定性评估和计算灰度值。(M、 N个)使用qRT-PCR评估IV型胶原和纤维连接蛋白的相对mRNA水平。所有数据均表示为平均值±标准偏差（SD）。与对照组相比，##P<0.01；#P<0.05；与模型组相比，**P<0.01；*P<0.05；与pCDNA-HIF-1α相比，@P<0.05。H–水蛭素；HG——高糖；FN–纤维连接蛋白；IV-C–IV型胶原；HIF-1α-低氧诱导因子-1α；PBS——对照组；HG+H——高糖+水蛭素组；HG+shRNA-HIF-1α-高糖+HIF-1 a基因敲除组；pcDNA-HIF-1α-HIF-1α过表达组；pcDNA-HIF-1α+H–HIF-1β过度表达+水蛭素组。
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