G3BP1-linked mRNA partitioning supports selective protein synthesis in response to oxidative stress

doi:10.1093/nar/gkaa376

.2020年7月9日；48(12):6855-6873.

doi:10.1093/nar/gkaa376。

G3BP1-linked mRNA分配支持氧化应激反应中的选择性蛋白质合成

附属公司

¹温哥华前列腺中心，加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华。
²加拿大不列颠哥伦比亚大学高通量生物中心。
^三加拿大卑诗省温哥华市卑诗省癌症研究中心分子肿瘤学系。

PMID： 32406909
预防性维修识别码： PMC7337521型
内政部： 10.1093/nar/gkaa376

G3BP1-linked mRNA分配支持氧化应激反应中的选择性蛋白质合成

Syam Prakash Somasekharan公司等。核酸研究. 2020.

.2020年7月9日；48(12):6855-6873.

doi:10.1093/nar/gkaa376。

附属公司

¹加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市温哥华前列腺中心。
²加拿大不列颠哥伦比亚大学高通量生物中心。
^三加拿大卑诗省温哥华市卑诗省癌症研究中心分子肿瘤学系。

PMID： 32406909
预防性维修识别码：第7337521页
内政部： 10.1093/nar/gkaa376号

摘要

在应激期间，细胞限制能量消耗mRNA的翻译，以维持代谢平衡。RNA结合蛋白（RBP）将mRNAs序列插入RNA颗粒可减少其翻译，但RBP是否也能将特定转录物分割为多聚体（PS），以指导癌症中的选择性翻译和应激适应尚不清楚。为了研究细胞应激下的转录分配，我们对前列腺癌PC-3细胞PS中富集的mRNA进行了分类，定义为多聚体分馏和RNA测序（RNAseq），并将其与已知SG-nucleator蛋白G3BP1复合的mRNA相比较，定义为空间限制酶标记和RNAseque。通过比较短期亚砷酸盐诱导的氧化应激前后的这些区室，我们确定了三大类转录物，即G3BP1相关和PS缺失的转录物，G3BP1解离和PS富集的转录物，以及G3BP1相关但PS富集的转录物。氧化应激深刻地改变了转录物在这些隔间的分配。在亚砷酸盐胁迫下，G3BP1-associated和PS-depleted转录物与编码的线粒体蛋白表达减少、与G3BP1编码的细胞周期无关的富含PS的转录物以及表达增加的细胞保护蛋白相关，而G3BP1相关和PS富集编码蛋白的转录物参与了不同的应激反应途径。因此，G3BP1引导转录物分割以重新编程mRNA翻译并支持应激适应。

©作者2020。由牛津大学出版社代表核酸研究出版。

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数字

**图1。**
分离富含PS-和不完全PS-的转录本及其验证。(A类)使用AHA（叠氮高丙氨酸）介导的CLICK方法检测未经处理或亚砷酸盐处理的细胞中新合成的蛋白质（36）。在无AHA培养基中培养的细胞作为对照。注意，亚砷酸盐胁迫降低了新蛋白质的合成。(B类)未经处理或亚砷酸盐处理的细胞的多胞体痕迹。(C类)火山图显示对亚砷酸盐处理的PS富集或PS缺失转录物。左边的蓝色球表示PS完成的成绩单（log₂折叠−1.0及以下，*P（P）*值<0.05），一些转录物的名称和相应的通路以蓝色显示。右侧的红色小球表示富含PS的成绩单（log₂折叠1.0及以上；*P（P）*值<0.05），一些转录本的名称和相应的路径显示为红色。灰色球表示未改变/无意义的转录本。(D类)比较PSseq数据和总转录组数据的维恩图。(E类)通过qRT-PCR使用从载体处理/未处理（UT）或亚砷酸盐处理（ARS）细胞中提取的多体RNA验证选定转录物的PSseq数据。显示了三个独立实验的平均值±SD****P（P）*< 0.001; ***P（P）*< 0.01; ns，无显著性。(F类)使用未经处理/载体处理（UT）或亚砷酸盐处理细胞的Western blotting验证选定转录物的PSseq数据。

**图2。**
PS富集和PS缺失转录物的通路分析和功能研究。(A类)使用Metascape软件对富含PS和不完全PS的转录本进行基因本体分析(http://metascape.org). 耗氧量（OCR）(B类)和细胞外酸化率（ECAR）(C类)使用Seahorse XF24细胞外通量分析仪通过实时测量确定（详见方法）。显示了五个独立实验的平均值±SD。(D类)未经处理或亚砷酸盐处理的细胞中ATP的测量。显示了三个独立实验的平均值±SD***P（P）*<0.01。(E类)未经处理或亚砷酸盐处理的细胞经碘化丙啶染色后的细胞周期分析，并通过FACS进行分析。

**图3。**
用于提取G3BP1相关蛋白和转录物的APEX方法。(A类)提取和比较G3BP1相关蛋白和转录物的模式。G3BP1-APEX以绿点表示，在载体处理的细胞中呈扩散状态，而在亚砷酸盐处理的细胞内呈聚集和扩散状态。有关详细信息，请参见方法。(B类)使用SG蛋白TIA-1通过免疫荧光评估APEX-G3BP1共定位。载体处理细胞和亚砷酸盐处理细胞的APEX-G3BP1免疫染色图像的一部分被放大并显示在底部面板上。请注意，G3BP1主要以扩散形式出现在载体处理细胞中（红色箭头），而在亚砷酸盐处理细胞中则以聚集形式（白色箭头）和扩散形式出现。刻度，10 um(C类)Western blot显示使用抗生物素抗体检测的生物素化蛋白（1-4通道和6-9通道）、使用抗G3BP1抗体检测的G3BP1-APEX融合蛋白和使用抗APX2（APEX2）检测的G3GP1（内源性）、G3BP1-APEX融合蛋白和单独APEX检测的生物素化蛋白（APEX）抗体（第三组）。GAPDH用作加载控制。(D类)Western blot分析检测非应激和亚砷酸盐处理细胞中与APEX-G3BP1复合物相关的蛋白质。

**图4。**
G3BP1相关蛋白和通路分析。(A类)维恩图显示了G3BP1相关蛋白在非应激和亚砷酸盐应激细胞中的比较和分类（4类）（更多详细信息见正文）。(B类)属于上述不同类别的蛋白质列在带有相应色度的方框中。文献中已经报道的SG/G3BP1相互作用蛋白用白色字母表示，而当前研究中发现的新蛋白用黑色字母表示。(C类)使用Metascape软件使用上述四类蛋白质进行基因本体分析(http://metascape.org).

**图5。**
G3BP1相关转录物的RNA序列。火山图显示G3BP1相关转录物，并进行比较：(A类)G3BP1-pex-ARS/G3BP1-pex-UT；(B类)G3BP1-APEX-ARS/CTRL-APEX-ARS和(C类)G3BP1-APEX-UT/CTRL-APEX-UT（详见正文）。(D类)维恩图显示了G3BP1相关转录物在非应激和亚砷酸盐应激中的比较，将转录物分为四组，即应激依赖型（绿色阴影）、应激敏感型（紫色阴影）、胁迫依赖型（浅棕色阴影）和具有减少或分离交互作用的转录物（灰色阴影）亚砷酸盐胁迫后。

**图6。**
验证G3BP1相关转录本。从载体处理或亚砷酸盐处理的细胞中提取的选定G3BP1相关mRNA使用图中所示的转录物特异性引物进行qRT-PCR。显示了三个独立实验的平均值±SD****P（P）*< 0.001; ***P（P）*< 0.01; **P（P）*< 0.05.

**图7。**
G3BP1相关转录物与PS的分类及其基因本体分析。(A类)说明应激PC-3细胞中G3BP1-associated和解离/减少的转录物在（PS富集）或（PS缺失）与PS之间的分区的维恩图显示了四种类型；类别。A-D.G3BP1分区转录本的基因本体分析(B类)对应于类别。A中(C类)对应于类别。B和(D类)对应于类别。C、使用Metascape软件。

**图8。**
G3BP1分区转录本的蛋白质表达和定位。(**A–F**)核糖核酸就地如图所示，使用mRNA探针对不同G3BP1分区转录物进行杂交（红色面板）。这个现场用抗G3BP1抗体（绿色面板）对载玻片进行IF染色，以检测在有或无应激状态下与G3BPl的共定位。每个主图形面板的一部分被放大并显示为插件。刻度，10 um(**G公司**)选定的G3BP1分区转录本的Western blot分析（详见材料和方法）。(**H（H）**)使用未经处理或亚砷酸盐处理的细胞中的抗BAX（2D2）抗体检测到激活的BAX。每个主图形面板的一部分被放大并显示为插件。白色箭头指向代表激活BAX的点。刻度，10 um(我)BAX激活的量化。显示了三个独立实验的平均值±SD***P（P）*< 0.01.

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1. Sonenberg N.，Hinnebusch A.G.，真核生物翻译起始的调控：机制和生物靶点。单元格。2009; 136:731–745.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Anderson P.，Kedersha N.。明显强调：eIF2、TIA-1和应激颗粒在蛋白质翻译中的作用。细胞应激伴侣。2002; 7:213–221.-项目管理咨询公司-公共医学
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1. Anderson P.，Kedersha N.，《应激颗粒：RNA分类之道》。生物化学趋势。科学。2008; 33:141–150.-公共医学
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[3] Anderson P.，Kedersha N.。明显强调：eIF2、TIA-1和应激颗粒在蛋白质翻译中的作用。细胞应激伴侣。2002; 7:213–221.-项目管理咨询公司-公共医学

[4] Anderson P.，Kedersha N.。明显强调：eIF2、TIA-1和应激颗粒在蛋白质翻译中的作用。细胞应激伴侣。2002; 7:213–221.-项目管理咨询公司-公共医学

[5] Anderson P.、Kedersha N.《RNA颗粒》。细胞生物学杂志。2006; 172:803–808.-项目管理咨询公司-公共医学

[6] Anderson P.、Kedersha N.《RNA颗粒》。细胞生物学杂志。2006; 172:803–808.-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Anderson P.，Kedersha N.，《应激颗粒：RNA分类之道》。生物化学趋势。科学。2008; 33:141–150.-公共医学

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[9] Anderson P.、Kedersha N.、Ivanov P.、压力颗粒、P-体和癌症。生物化学。生物物理学。行动。2015; 1849:861–870.-项目管理咨询公司-公共医学

[10] Anderson P.、Kedersha N.、Ivanov P.、压力颗粒、P-体和癌症。生物化学。生物物理学。行动。2015; 1849:861–870.-项目管理咨询公司-公共医学

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