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.2021年6月；17(6):1393-1409.
doi:10.1080/15548627.2020.1761742。 Epub 2020年5月25日。

CASP9（caspase 9）参与IGF2R/CI-MPR的胞内转运

韩杰（音译） 1, 莱斯利·A·戈尔茨坦 1, 文厚（Wen Hou） 1, 西蒙·沃特金斯 2, 汉娜·拉宾诺维奇 1
附属公司

CASP9（caspase 9）参与IGF2R/CI-MPR的胞内转运

韩杰（音译）等。 自噬. 2021年6月.

摘要

最近，我们报道了在HSP90抑制作用下，内胚层膜上CASP9原结构域的增加表达可介导不涉及CASP9凋亡活性的细胞保护作用。我们在这里报道，内胚体膜CASP9的非凋亡活性促进了IGF2R/CI-MPR从内胚体逆行转运到跨高尔基网络，表明CASP9参与了内胚体分选和溶酶体生物发生。CASP9缺陷的细胞显示CTSD（组织蛋白酶D）和其他酸性水解酶的错配，晚期内体的积累，以及巴非霉素A的降解减少1-敏感蛋白。在没有CASP9的情况下，IGF2R会发生显著的降解，并且通过重新表达非催化性CASP9公司突变体。CASP9的这种内体活性可能由本文新发现的CASP9与内体膜转运复合物成分的相互作用介导。这些内体复合体包括逆转录体VPS35和SNX二聚体SNX1-SNX5和SNX2-SNX6，它们参与IGF2R检索机制。此外，CASP9与参与内胚体ESCRT降解途径启动的HGS/HRS/ESCRT-0和CLTC（网格蛋白重链）相互作用。我们认为，内胚体CASP9抑制内胚体膜降解亚结构域启动ESCRT介导的IGF2R降解，使其能够恢复到运输指定的内胚体细胞膜亚结构域。这些发现首次确定了CASP9在内质膜的细胞存活和非凋亡功能，内质膜是一个明显从细胞质凋亡小体中移除的部位。CASP9通过其非凋亡内体功能影响IGF2R的逆行转运，从而影响溶酶体的生物发生。缩写：ACTB：肌动蛋白β；ATG7：自噬相关7；巴非霉素A1; CASP：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；CLTC/CHC：氯氰菊酯，重链；组织蛋白酶D；ESCRT：转运所需的内体分选复合物；HEXB：己糖胺酶β亚基；HGS/HRS/ESCRT-0：肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物；IGF2R/CI-MPR：胰岛素样生长因子2受体；ILV：腔内小泡；KD：击倒；KO：淘汰赛；M6PR/CD-MPR：甘露糖-6-磷酸受体，阳离子依赖性；MEF：小鼠胚胎成纤维细胞；MWU：曼希特尼U检验；PepA：胃蛋白酶抑制素A；RAB7A:RAB7，RAS癌基因家族成员；SNX-BAR：用Bin/Amphiphysin/Rvs（BAR）结构域对连接蛋白二聚体进行分类；TGN：跨Golgi网络；TUBB：微管蛋白β；VPS26:VPS26逆转录酶复合物成分；VPS29:VPS29逆转录酶复合物成分；VPS35:VPS35逆转录酶复合物成分。

关键词：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9；HGS/HRS/ESCRT-0；IGF2R/CI-MPR；内体；溶酶体；逆转录酶。

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利益冲突声明

作者与本文的内容没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
CASP9参与溶酶体细胞定位和活性。（A）CASP9公司KD以与组织蛋白酶抑制剂相加的方式改变LAMP2的分布。HCT116细胞用CASP9公司存在E64D/pepA（每个10μM）或载体对照时的siRNA或非靶siRNA。通过共焦显微镜对细胞进行LAMP2（小鼠Ab sc-18822）和DAPI染色评估。比例尺：40μm。（B） LAMP2量化。数据是至少3个独立实验中每个处理大约50个细胞的平均值±SEM***=p<0.0001**=p<0.001（MWU）。额外的抗LAMP2抗体染色如图所示图S1和S2（C）A.（D-L）CASP9中使用的细胞裂解物的免疫印迹影响溶酶体清除SDS不溶性泛素化蛋白的效率酪蛋白9KO MEF和CASP9公司KO肿瘤细胞。（D-E）酪蛋白9与WT-MEF相比，KO-MEF（克隆I和克隆II）的泛素化聚集体溶酶体清除率降低。WT和酪蛋白9用MG132（1μM）处理KO-MEF，并通过滤阱分析检测得到的SDS不溶性泛素化聚集体。每次治疗都会出现重复的斑点。（E） D中显示的免疫印迹SDS不溶部分的密度定量。数据是三个独立实验中四个重复的平均值±SEM，结果相似。星号表示p<0.05（MWU）的统计显著性。（F-I）酪蛋白9用编码小鼠非催化性CASP9的质粒转染可逆转KO-MEFC325A型突变体。F和H中所示结果的量化分别显示在G和I中，是E中所述的平均值±SEM。（J）CASP9在F和H所用细胞中的表达水平。（K）CRISPR-Cas9中泛素化聚集体的溶酶体清除率降低CASP9公司KO A549细胞通过转染编码WT CASP9或非催化CASP9的质粒而被挽救C287A型突变体。（五十） CASP9在其中一种用于K（M-N）BafA1敏感降解的A549细胞制剂中的表达在亲代/WT对照和CRISPR-Cas9中CASP9公司KO克隆细胞系，包括A549（M）和HCT116（N）#1和#2表示使用不同的CRISPR-CAS9进行的独立实验CASP9公司每个细胞系的KO克隆。数据是至少2个独立实验中6个重复的平均值±SEM*p<0.05（MWU）
图2。
图2。
晚期内体的积累增强酪蛋白9KO MEF细胞通过转染编码非催化CASP9的质粒而减少C325A型突变体。（A-B）晚期内体的积累酪蛋白9转染CASP9后KO MEF显著降低C325A型.比例尺：500 nm。白色箭头表示少数内体；箭头–溶酶体。（B） 囊泡内体的定量。数据为3个独立实验中50个细胞内涵体的平均值±SEM***=p<0.0001（MWU）。（C-D）CASP9表达改变了对照组和MG132处理的MEF中RAB7A的分布模式。重量，酪蛋白9KO MEF和胱天蛋白酶9转染CASP9的KO-MEFC325A型用载体或MG132处理（1μM，16 h），并通过共焦显微镜评估RAB7A分布模式和表达水平。比例尺：40μm。我们针对CRISPR-Cas9验证的独特RAB7A Abs（SC-10767）也获得了类似结果拉布7aKO电池。数据是三个实验中一个实验中至少50个细胞的平均值±SEM***=p<0.0001（MWU）。（E） C中所示的一个实验中细胞裂解物的免疫印迹
图3。
图3。
CASP9与内膜蛋白的关联。（A） GFP-RAB7A和DsRed-CASP9的彩色化C325A型联合转染到酪蛋白9KO MEF公司。底部面板图像中包括一个未转染的阴性对照细胞。比例尺：20μm。（B） HCT116细胞亚细胞分离后P100颗粒中CASP9与RAB7A和M6PR的关联。当从HCT116细胞裂解物（C）或P100亚细胞组分（D）免疫沉淀时，CASP9和RAB7A的（C-D）Co-IP。CASP9的（E-F）Co-IP与IGF2R/CI-MPR（E）和M6PR（F）。用编码3xFlag-CASP9的质粒转染细胞C287A型突变体，通过抗CASP9、抗Flag、抗IGF2R或抗M6PR Abs感染IP
图4。
图4。
CASP9表达水平影响溶酶体酶的成熟和激活。（A） 中的CTSD排序错误胱天蛋白酶9KO MEF公司。WT和酪蛋白9KO MEF用载体对照物或环己酰亚胺（CHX，0.5μg/ml，3或6 h）进行预处理。评估细胞裂解液和细胞培养液中前体（pCTSD）和成熟型CTSD的表达。（B） CRISPR-Cas9中CTSD和HEXB的错配CASP9公司KO HCT116细胞。（C） pCTSD和pHEXB在视频处理35或CASP9公司KD细胞。HCT116细胞用CASP9公司或视频处理35siRNAs 48小时，然后通过免疫印迹法评估指示蛋白的表达。（D） GLB1/半乳糖苷酶β和GUSB/葡萄糖醛酸酶β的比活性在酪蛋白9KO MEF与WT MEF的比较。数据为3个独立实验中每组6个重复的平均值±SEM，结果相同*=p<0.05**=p<0.001（MWU）。（E） BODIPY-FL-pepstatin A活染色显示WT中活性CTSD的差异表达，酪蛋白9KO，获救酪蛋白9KO MEF公司。比例尺：60μm。（F） BODIPY-FL-pepstatin A活染色的定量如D所示。数据是3个独立实验中每个实验中大约50个细胞的平均值±SEM***=p<0.0001（兆瓦）
图5。
图5。
CASP9与胞内转运复合物的相互作用。（A） HCT116细胞内源性CASP9和内源性VPS35的Co-IP。（B） 的Co-IP在体外翻译35S-CASP9冷在体外翻译VPS35。输入包括两个在体外翻译产品。（C） 的Co-IP在体外翻译35S-VPS35冷在体外翻译成CASP9。（D） HCT116细胞中内源性CASP9与内源性SNX1的共IP。（E） HCT116细胞内源性CASP9与内源性SNX2的Co-IP。（F） 的Co-IP在体外翻译35含有HCT116内源性SNX5的S-CASP9CASP9公司KO裂解物。输入包括HCT116的裂解物CASP9公司KO电池与在体外翻译35S-CASP9。（G） 的Co-IP在体外翻译35含有HCT116内源性SNX6的S-CASP9CASP9公司KO裂解物。输入包括的裂解物CASP9公司KO电池与在体外翻译35S-CASP9。（H-I）Co-IP在体外翻译35S-CASP9冷在体外翻译的SNX6（H），或在体外翻译35S-SNX6冷在体外翻译成CASP9（I）。免疫沉淀SNX5和SNX6在（F-I）中的免疫印迹未显示，因为co-IP蛋白的凝胶迁移相似。输入包括这两个在体外翻译的产品
图6。
图6。
IGF2R的降解CASP9公司KO克隆细胞系被BafA1、MG132或WT或非催化CASP9的再表达拯救C287A型突变体。（A）案例9共聚焦显微镜检测显示，KD显著降低IGF2R的表达。比例尺：100μm。（B） A中所示结果的量化。数据是3个独立实验中每个处理至少40个细胞的平均值±SEM***=p<0.0001（MWU）。（C）CASP9公司免疫印迹法检测KD降低IGF2R的表达。（D-F）CRISPR-CAS9中IGF2R的减少表达CASP9公司KO克隆细胞系（A549克隆3和19；HCT116克隆4和6；Cl.：克隆）在BafA1存在下被挽救。A549 CRISPR-Cas9标准CASP9公司KO克隆（3和19）由不同的gRNA产生。（G） IGF2R在CASP9公司用MG132处理KO A549细胞（1μM，16 h）可挽救细胞。（H） IGF2R在CASP9公司通过转染编码WT或非催化CASP9的质粒拯救KO A549细胞C287A型突变体
图7。
图7。
CASP9与内体降解亚域蛋白HGS和CLTC相互作用，并改变其表达水平。（A） 生理表达的CASP9和HGS的Co-IP。（B） CLTC与生理表达的CASP9（载体控制）或催化不活跃CASP9的Co-IPC287A型突变株稳定转染HCT116细胞。（C） DsRed的显色-CASP9C325A型内源性CLTC。用兔抗CLTC和Alexa Fluor 488抗兔抗体检测CLTC。比例尺：10μm。（D） HGS在CASP9公司KO细胞因WT或催化CASP9的过度表达而减少C287A型突变体。（E） 非催化CASP9编码基因的过度表达C325A型中的突变酪蛋白9KO-MEF降低CLTC的表达。对1、3、5、7、9号车道进行车辆控制，对2、4、6、8、10号车道进行MG132处理（1μM，16 h）。为了简化演示，图中未显示对照和MG132治疗。（F）CLTC上调以响应CASP9公司杜兰特。HCT116细胞接受非靶向对照（1–3道），CASP9公司（4-5车道），或CLTC公司（7–9车道）siRNAs。对1、4、7号车道进行车辆控制；泳道2、5和8用MG132处理，泳道3、6、9用硼替佐米（100 nM，16小时）处理。为了简化演示，图中未显示蛋白酶体抑制剂（不影响CASP9或CLTC的表达水平）
图8。
图8。
说明CASP9与内体降解亚结构域（HGS，CLTC）成分和调控IGF2R从内体逆行运输到TGN的检索亚结构域的相互作用的模型
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