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.2020年6月19日；48（11）：e63。
doi:10.1093/nar/gkaa270。

用于超高通量功能蛋白珠上筛选的DNA文库的拆分和混合组装

劳伦斯·林登堡 1, 托马斯·霍维宁 1, 凯利·范德维尔 1, 迈克尔·赫格 1 2, 迈克尔·R·斯奈思 2, 弗洛里安·霍尔菲尔德 1
附属公司

用于超高通量功能蛋白珠上筛选的DNA文库的拆分和混合组装

劳伦斯·林登堡等。 核酸研究. .

摘要

站点饱和库通过关注有限数量的合理选择的残基，减少了定向进化活动中的蛋白质筛选工作。然而，库合成效率不均衡会导致氨基酸偏倚，通过昂贵的寡核苷酸定制合成或使用专有库合成平台以高昂的成本进行补救。为了解决这些缺点，我们设计了一种方法，通过将dsDNA片段连接到生长的、表面固定的DNA上，在反复的分裂和混合循环中，在微球表面构建DNA文库。这种用于Beads上的Split-and-Mix库的方法命名为SplMLiB，应用于抗IgE亲和体（ZIgE）的定向进化，在800万个单克隆珠的表面生成160000个成员、4位点、饱和库。深度测序证实，库平衡良好（每个氨基酸5.1%±0.77），覆盖率（99.3%）。由于SplMLiB微球是单克隆的，因此它们能够在无细胞表达的油包水乳液液滴中直接进行功能筛选。基于FACS的文库珠分选使Kd中的命中率比野生型ZIgE提高了3.5倍，而最佳命中率的一致突变体提供了10倍的提高。利用SplMLiB，通过将高质量DNA文库生成与超高通量蛋白质筛选平台集成，加速了定向进化工作流。

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数字

图1。
图1。
用于站点饱和库固相克隆的SplMLiB设计。(A类)SplMLiB由许多DNA附着环组成，其中DNA固定在珠子表面（第一个附着环）或固定的DNA通过结扎延伸（随后的附着环）。珠子被分成不同的管，血管的数量对应于编码蛋白质中感兴趣的位置上所需数量的不同氨基酸变体。DNA添加之间混合珠子，确保实现位置变体的所有组合。这一过程可能会持续数轮，最终导致n个米哪里n个是每个附件的拆分数米是附件数。分裂中的每个管接收携带单个密码子变体的DNA片段，如仅针对第二轮SpliMLiB显示的下部虚线框所示。(B类)SplMLiB产生一个位点饱和文库，由每个紧密包裹在相同DNA中的珠子表示。
图2。
图2。
珠子表面的设计和DNA的固相操作。(A类)珠子设计用于显示两种叠氮化物（标记为“N三’）和SpyTag（标记为‘ST’）部件（补充图S1中描述的表面改性）。(B类)荧光蛋白和DBCO-功能化DNA固定之前（灰色）和之后（黑色），DNA涂层珠经Esp3I处理（37°C下2小时）后（中间直方图），荧光衍生荧光强度珠的流式细胞术分析以及将经Esp3I处理的珠子暴露于荧光标记的DNA双链中后，该双链与T4 DNA连接酶缓冲液中的珠子固定DNA的5′-外悬互补，带有（黑色）或没有（灰色）T4 DNA连接酶（底部直方图）。用于生成该面板的DNA序列的详细信息如补充图S4所示。(C类)珠上组装的示意图，允许近距离三个密码子的潜在饱和。最后一个附珠的DNA组装图显示在面板顶部，构建中使用的三个DNA片段如下所示。限制位点用红色表示，靶密码子用绿色表示，用于结扎期间杂交的序列用蓝色表示。第一种是PCR产生的扩增子（片段三)附在珠子上(通过无铜点击化学），并通过Esp3I消化。使用寡核苷酸双链延长珠上的DNA（片段2)携带5′-磷酸化内聚端；结扎前用于确保双面打印纸（稳定性填充器）稳定性的顺序以对角线形式表示。一旦通过结扎将这种双链附加到珠子上，通过BspQI消化产生新的内聚端（并去除稳定性填充物）。最后，另一个PCR扩增子（片段1)用粘结端（使用BspQI）分别制备，连接到珠固定DNA。用于生成该面板的DNA序列的详细信息如补充图S5所示。(D类)流式细胞术分析未经处理的珠子（顶部轨迹）、携带全长起始模板（即一端为FAM，另一端为DBCO，中间轨迹）的珠子以及经过C中描述的3密码子SplMLiB过程的珠子(E类)面板C中显示的示例性珠表面组装结构的Sanger测序色谱图（由直接从珠获得的PCR扩增子模板化），将要突变的密码子设计为非常接近（底部）。如图C所示，绿色表示突变位置，而蓝色表示用于结扎的序列。
图3。
图3。
用于Z的SplMLiB库的设计和工作流程免疫球蛋白E. (A类)Z的模型结构免疫球蛋白E（由Swissmodel（118）建模，基于PDB ID为2m5a（119）的模板，指示SplMLiB库中目标的四个位置的位置。(B类)最终Z的示意图免疫球蛋白E在四个SplMLiB附件中组装的表达式构造。Z轴免疫球蛋白E序列被分成四组片段，每一组片段都携带一个目标位置。这些SplMLiB输入片段是通过PCR（片段集片段时间10&碎片M35型)或通过部分互补寡核苷酸的退火（片段集fragM18型&碎片28国道). 第一组要固定的碎片，碎片M35型，用DBCO进行功能化，允许通过无铜点击化学将片段固定到叠氮功能化珠。最后一组要结扎的碎片，frag时间10，与FAM一起使用，允许监控SplMLiB库组装总效率。包含在PCR生成片段末端的Esp3IⅡ型位点支持无缝连接到寡核苷酸二倍体，该二倍体通过设计具有5′-悬垂，并且已通过酶促5′-磷酸化。(C类)对SplMLiB工作流程进行了示意性描述。在第一次附着中，使用无铜点击化学（i）将DNA固定在分离的珠子群体上，然后混合珠子（ii）并进行珠上限制反应（iii），以生成5′-悬垂。接下来，再次分裂珠子，并将带有5′-悬链互补（在步骤iii中生成）的5′-磷酸化合成双链DNA连接到珠子固定的DNA。在随后的混合（v）和分离珠子后，珠子结合的DNA准备通过另一个5′-磷酸化的合成双链DNA片段（vi）进行延伸。然后混合珠子（vii）并将其分开进行最后的结扎（viii），以添加带有5′-悬垂的PCR片段（由离珠II型限制产生），该片段补充倒数第二个片段，即5′-磷酸化合成双链DNA。最后一组片段的每个PCR扩增子在远端用5′-FAM标记，用于混合最终文库的流式细胞术分析（ix）。(D类)流式细胞术分析SplMLiB文库构建效率。通过固定全长Z制备阳性对照（PC）免疫球蛋白E通过点击珠子上的化学反应获得DNA片段（末端用荧光素标记为库珠DNA）。不含任何DNA的未处理珠子作为阴性对照（NC）。
图4。
图4。
Z的分析免疫球蛋白ENGS的SplMLiB库。(A类)方框图和胡须图显示了四个目标位点中所有20个氨基酸的频率。按照惯例，Tukey胡须沿着四分位间距的1.5倍延伸，或延伸至最高/最低点，以较短者为准。晶须范围外的唯一数据点（对于T10P）由黑点表示。(B类)所有理论库变体的频率分布按在NGS中观察到的频率顺序排列。(C类)在SpliMLiB文库测序片段的每个位置发生插入和缺失的频率。(D类)在SplMLiB库中测序片段的每个位置发生的非目标替换频率。在面板C和D中，阴影条表示四个目标密码子的位置（从左到右，T10、M18、G28和M35）。
图5。
图5。
基于微乳的Z珠显示筛选免疫球蛋白ESplMLiB库。(A类)一轮支持SplMLiB的Z定向进化的示意图免疫球蛋白E将SpliMLiB微球（i）单独封装在37°C的乳液IVTT中1 h（ii），足够的时间允许两个Z免疫球蛋白E-SpyCatcher变异体的表达及其在珠表面上的SpyTag-SpyCather介导的固定作用，之后乳剂被破坏，清洗的珠暴露于Cy5标记的IgE（iii），然后根据Cy5信号对珠进行流式细胞术分选（iv）。(B类)SpliMLiB Z流式细胞仪分选过程中记录的代表性直方图免疫球蛋白E图书馆珠子。显示了每个分拣门1-4的荧光强度范围。(C类)对从B组中列出的分类门收集的、回收的和亚克隆的DNA进行分析。DNA用于在大量（即非乳化条件下，在SpyTag功能化微球存在的情况下）IVTT中表达蛋白质。捕获了SpyCatcher融合蛋白的微球随后与200 nM IgE-Cy5孵育，并通过流式细胞仪进行分析。将Cy5荧光强度归一化为用暴露于纯化Z的珠子制备的样品免疫球蛋白E野生型-SpyCatcher蛋白（WT，灰条）。阴性对照（NC）为珠子未暴露于任何Z免疫球蛋白E-SpyCatcher蛋白。(D类)分析从FACS分拣门4的严格分拣文库输出中获得的细菌表达和纯化变体。用Z绑定的珠子免疫球蛋白E-SpyCatcher变体与200 nM IgE-Cy5孵育，并通过流式细胞术进行分析。Z轴免疫球蛋白E野生型-将SpyCatcher（标记为WT）作为对照，并用于使所有荧光值正常化。进一步分析显示最高Cy5中值信号的变种（变种33，用一个星号标记）和第二高信号（变种44，用两个星号标识）。(E类)作为面板D，除了从未排序的SplMLiB输入库珠子派生的48个随机选取的克隆。(F类)在显示比Z更高结合信号的选定变体中遇到的氨基酸的频率免疫球蛋白E野生型-间谍捕手（共17人）。每个位置最常见的氨基酸用粗体表示以强调。
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引用人

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