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.2021年6月；17(6):1316-1329.
doi:10.1080/155486272020.176014。 Epub 2020年5月6日。

差异性和时间依赖性自噬激活对亨廷顿病模型疗效的影响

根据Ludvik Brattás 1, 鲍勃·埃尔斯巴赫 1, 索菲亚·马德森 1, 丽贝卡·佩特里 1, 约翰·雅各布森 1, 卡罗琳娜·皮尔斯 1
附属公司

差异性和时间依赖性自噬激活对亨廷顿病模型疗效的影响

根据Ludvik Brattás等。 自噬. 2021年6月.

摘要

激活宏自噬/自噬是降解和去除聚集蛋白的关键机制，可以成功逆转各种模型系统中的亨廷顿病表型。目前尚不清楚亨廷顿病进展过程中需要考虑神经元自噬损伤以达到治疗效果。在本研究中，我们使用HTT（huntingtin）蛋白聚集的小鼠模型来研究不同的自噬激活方法和时间如何影响自噬活化治疗的疗效体内。我们发现人类的过度表达TFEB公司自噬的主要调节因子并没有减少突变HTT聚集。另一方面，贝肯1过度表达是一种在自噬体形成中起关键作用的自噬调节因子，可部分清除突变HTT聚集体并恢复神经元病理，但仅在疾病进展早期给予。什么时候？贝肯1在发生显著突变HTT积累和自噬损伤的后期给药，贝肯1过度表达并没有拯救突变的HTT相关表型。总之，这些结果表明，用于激活自噬的靶点以及自噬激活的时间对实现有效的治疗效果至关重要。缩写：AAV：腺相关病毒载体；ACTB：肌动蛋白β；BECN1:beclin 1，自噬相关；DAPI:4'，6-二氨基-2-苯基吲哚；GO：基因本体；HD：亨廷顿病；HTT：亨廷顿；ICQ：李氏强度相关商；IHC：免疫组织化学；LAMP1：溶酶体相关膜蛋白1；MAP1LC3B/LC3B：微管相关蛋白1轻链3β；mHTT：突变体亨廷顿蛋白；主成分分析；PPP1R1B/DARPP-32：蛋白磷酸酶1调节性抑制剂亚单位1B；SQSTM1：隔离体1；TFEB：转录因子EB；WB：western blot；WT：野生型。

关键词：腺相关病毒载体；BECN1/beclin-1；亨廷顿病；TFEB；自噬；宏观自噬；神经变性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1。
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基于AAV的HD模型允许对疾病进展进行研究。（A） AAV-m示意图HTT公司和AAV-HTT公司向量和实验工作流。（B） AAV中均存在截短的人类HTT和人类mHTT蛋白的表达水平-HTT公司-和AAV-mHTT公司-10天和3周后注射动物。在任何时间点，任何组之间都没有显著差异。（n=9；每组4-4只动物）。AAV-m后10天，（C-G）mHTT聚集体累积HTT公司注入。这个数量增加了6倍，增加了3周。AAV公司-HTT公司-注射的动物没有形成任何聚集物。（n=20；每组4-4只动物）。（H） AAV-m中PPP1R1B表达水平降低HTT公司-3周后注射动物。10天后，AAV之间无显著差异-HTT公司-和mHTT公司-注射动物。（n=11，持续10天，n=9，持续3周；每组4-4只动物）***p<0.001**p<0.01*p<0.05；根据D’Agostino-Pearson综合正态性检验在B和H中定义的正态分布，使用G中的双尾双样本T检验或单向ANOVA检验。所有数据显示为平均值±SEM。WB值归一化为10d AAV-HTT公司表达水平并校正为ACTB（肌动蛋白β）值。比例尺：50μm
图1。
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基于AAV的HD模型允许对疾病进展进行研究。（A） AAV-m示意图HTT公司和AAV-HTT公司向量和实验工作流。（B） AAV中均存在截短的人类HTT和人类mHTT蛋白的表达水平-HTT公司-和AAV-mHTT公司-10天和3周后注射动物。在任何时间点，任何组之间都没有显著差异。（n=9；每组4-4只动物）。AAV-m后10天，（C-G）mHTT聚集体累积HTT公司注入。这个数量增加了6倍，增加了3周。AAV公司-HTT公司-注射的动物没有形成任何聚集物。（n=20；每组4-4只动物）。（H） AAV-m中PPP1R1B表达水平降低HTT公司-3周后注射动物。10天后，AAV之间无显著差异-HTT公司-和mHTT公司-注射动物。（n=11，持续10天，n=9，持续3周；每组4-4只动物）***p<0.001**p<0.01*p<0.05；根据D’Agostino-Pearson综合正态性检验在B和H中定义的正态分布，使用G中的双尾双样本T检验或单向ANOVA检验。所有数据显示为平均值±SEM。WB值归一化为10d AAV-HTT公司表达水平并校正为ACTB（肌动蛋白β）值。比例尺：50μm
图2。
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米HTT公司过度表达改变纹状体神经元蛋白质水平上的自噬。（A-D）AAV-m感染后第10天，检测到自噬标记物SQSTM1、LC3-II的表达水平降低，同时LC3-II:LC3-I比率降低HTT公司注射。注射后3周，在AAV-m中检测到相反的作用HTT公司-注射动物。（SQSTM1的n=11；LC3的n=8；每组4-4只动物）。（E-J）在3周的AAV-m中，LC3和SQSTM1点的数量和大小都显著增加HTT公司-注射动物与10天相比（LC3的n=15；SQSTM1的n=15,12和3周；每组3–3只动物）。（K） BECN1在10天后积累，但3周后在AAV-m中没有变化HTT公司-注射小鼠。（n=7；每组4-4只动物）。AAV-m感染后3周，（L-N）BECN1斑点数保持不变，而斑点面积显著减少HTT公司注射与10d相比（n=12；每组3–3只动物）***p<0.001**p<0.01*p<0.05；采用双尾双样本T检验。所有数据均显示为平均值±SEM。WB值标准化为10天或3周AAV-HTT公司表达水平并校正为ACTB值。IHC值标准化为10 d AAV-mHTT公司点号或面积。比例尺：25μm
图2。
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米HTT公司过度表达改变纹状体神经元蛋白质水平上的自噬。（A-D）在AAV-m后10天检测到自噬标记物SQSTM1、LC3-II的表达水平降低，同时LC3-II:LC3-I比率降低高温涡轮增压器注射。注射后3周，在AAV-m中检测到相反的作用HTT公司-注射动物。（SQSTM1的n=11；LC3的n=8；每组4-4只动物）。（E-J）在3周的AAV-m中，LC3和SQSTM1点的数量和大小都显著增加HTT公司-注射动物与10天相比（LC3的n=15；SQSTM1的n=15,12和3周；每组3–3只动物）。（K） BECN1在10天后积累，但3周后在AAV-m中没有变化HTT公司-注射小鼠。（n=7；每组4-4只动物）。AAV-m感染后3周，（L-N）BECN1斑点数保持不变，而斑点面积显著减少HTT公司注射与10d相比（n=12；每组3–3只动物）***p<0.001**p<0.01*p<0.05；采用双尾双样本T检验。所有数据均显示为平均值±SEM。WB值标准化为10天或3周AAV-HTT公司表达水平并校正为ACTB值。IHC值标准化为10 d AAV-mHTT公司点号或面积。比例尺：25μm
图3。
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米HTT公司过度表达改变纹状体神经元转录水平上的自噬。（A） AAV-m后3周大多数差异表达基因HTT公司注射量明显减少。（n=3用于HTT公司m的n=2高温涡轮增压器动物/组）。（B） Panther pathway GO分析热门显示AAV-m后差异下调基因参与HDHTT公司3周注射。灰色条表示褶皱富集。三角形点显示p值。数字表示每个GO术语中显著下调的基因数量。（n=3用于HTT公司对于m，n=2HTT公司动物/组）。（C） 增强自噬的转录因子热图显示，注射后10天表达增加，3周表达减少。（n=2用于HTT公司对于m，n=3HTT公司动物/组在第10天，n=3HTT公司对于m，n=2HTT公司动物/组在3周时间点）。（D） 在注射后10天和3周，参与自噬的显著差异表达基因的热图显示，在注射后第10天和第3周，其表达水平相反。（n=2用于HTT公司对于m，n=3HTT公司动物/组在第10天，n=3HTT公司对于m，n=2HTT公司在3周时间点的动物/组）*p<0.05；Benjamini-Hochberg方法被用作Wald检验中显著性的临界值
图3。
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米HTT公司过度表达改变纹状体神经元转录水平上的自噬。（A） AAV-m感染3周后大多数差异表达基因HTT公司注射量明显减少。（n=3用于HTT公司对于m，n=2HTT公司动物/组）。（B） Panther pathway GO分析热门显示AAV-m后差异下调基因参与HDHTT公司3周注射。灰色条表示褶皱富集。三角形点显示p值。数字表示每个GO术语中显著下调的基因数量。（n=3用于HTT公司对于m，n=2HTT公司动物/组）。（C） 增强自噬的转录因子热图显示，注射后10天表达增加，3周表达减少。（n=2用于HTT公司对于m，n=3HTT公司动物/组在第10天，n=3HTT公司对于m，n=2HTT公司动物/组在3周时间点）。（D） 参与自噬的显著差异表达基因在注射后10天和3周的热图显示出相反的表达水平。（n=2用于HTT公司对于m，n=3HTT公司动物/组，第10天，n=3高温涡轮增压器对于m，n=2HTT公司动物/组在3周时间点）*p<0.05；Benjamini-Hochberg方法被用作Wald检验中显著性的临界值
图4。
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人类自噬诱导TFEB公司过度表达并不能逆转HD样表型I。（A）总结AAV-m联合给药的实验流程HTT公司和AAV-TFEB公司（B）WB分析验证成功的人为因素TFEB公司联合注射AAV-m后过度表达HTT公司和TFEB公司（n=6，m）HTT公司和5用于TFEB公司共注射动物；每组4-4只动物）。（C和D）IHC分析验证成功TFEB公司联合注射AAV-m后过度表达HTT公司+TFEB公司使用TFEB抗体。（E–G）AAV共注入-TFEB公司和AAV-mHTT公司两者并没有减少mHTT的聚集。（n=20；每组4-4只动物）。（H） AAV-m中PPP1R1B蛋白水平相似高温涡轮增压器+TFEB公司联合注射动物与AAV-mHTT公司单独用WB测量。（n=4；每组4-4只动物）***p＜0.001**p＜0.01*p<0.05；采用双尾双样本T检验。所有数据均显示为平均值±SEM。WB值归一化为AAV-mHTT公司表达水平并校正为ACTB值。比例尺：C和D的20μm；E和F为50μm
图4。
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人类自噬诱导TFEB公司过度表达并不能逆转HD样表型I。（A）总结AAV-m联合给药的实验流程HTT公司和AAV-TFEB公司（B）WB分析验证成功的人为因素TFEB公司联合注射AAV-m后过度表达HTT公司和TFEB公司（n=6，m）HTT公司和5用于TFEB公司共注射动物；每组4-4只动物）。（C和D）IHC分析验证成功TFEB公司联合注射AAV-m后过度表达HTT公司+TFEB公司使用TFEB抗体。（E–G）AAV共注入-TFEB公司和AAV-mHTT公司两者并没有减少mHTT的聚集。（n=20；每组4-4只动物）。（H） AAV-m中PPP1R1B蛋白水平相似HTT公司+TFEB公司联合注射动物与AAV-mHTT公司单独用WB测量。（n=4；每组4只动物）***p<0.001**p<0.01*p<0.05；采用双尾双样本T检验。所有数据均显示为平均值±SEM。WB值归一化为AAV-mHTT公司表达水平并校正为ACTB值。比例尺：C和D的20μm；E和F为50μm
图5。
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人类自噬诱导TFEB公司过度表达不会逆转HD样表型II。（A–D）AAV后自噬标记物SQSTM1和LC3-II的表达水平增加-TFEB公司联合注射。注射后3周，各组之间的LC3-II:LC3-I比率没有变化。（n=8；每组4-4只动物）。与AAV-m相比，联合注射动物的（E–G）LC3点数量和大小均显著增加HTT公司（n=12；每组3至3只动物）。（H–J）与AAV-m相比，共注射动物中SQSTM1点的数量显著增加HTT公司独自一人。（n=10；每组3至3只动物）***p<0.001**p<0.01*p<0.05；采用双尾双样本T检验。所有数据均显示为平均值±SEM。WB值归一化为AAV-m高温涡轮增压器表达水平并校正为ACTB值。IHC值标准化为AAV-mHTT公司点号或面积。比例尺：25μm
图5。
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人类自噬诱导TFEB公司过度表达不会逆转HD样表型II。（A–D）AAV后自噬标记物SQSTM1和LC3-II的表达水平增加-TFEB公司联合注射。注射后3周，各组之间的LC3-II:LC3-I比率没有变化。（n=8；每组4-4只动物）。与AAV-m相比，联合注射动物的（E–G）LC3点数量和大小均显著增加HTT公司（n=12；每组3至3只动物）。（H–J）与AAV-m相比，共注射动物中SQSTM1点的数量显著增加HTT公司独自一人。（n=10；每组3至3只动物）***p<0.001**p<0.01*p<0.05；采用双尾双样本T检验。所有数据均显示为平均值±SEM。WB值归一化为AAV-mHTT公司表达水平并校正为ACTB值。IHC值标准化为AAV-mHTT公司点号或面积。比例尺：25μm
图6。
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小鼠早期但非晚期自噬诱导贝肯1过度表达逆转HD-like表型I。（A）总结AAV-m联合递送的实验工作流程HTT公司和AAV-贝克1在不同的时间点。（B–E）WB和IHC分析验证成功贝肯1共注射m后过度表达HTT公司和贝肯1在不同的时间点交付。（n=4；每组4-4只动物）。（F–I）AAV共注入-贝肯1和AAV-mHTT公司降低了mHTT的聚集性，但仅在贝肯1-早期组。（n=20；每组4-4只动物）。（J–N）PPP1R1B蛋白水平在贝肯1-早期组与其他动物比较，用密度计和WB测量。（IHC组n=20只；每组4-4只，WB组n=4只；每组4~4只）***p<0.001**p<0.01*p<0.05；根据D'Agostino-Pearson综合正态性检验定义的正态分布，使用单向方差分析或非参数Kruskal-Wallis检验。所有数据均显示为平均值±SEM。WB值归一化为AAV-mHTT公司-注入表达水平并校正为ACTB值。密度测定值归一化为AAV-mHTT公司.比例尺：C-E为25μm，其余为50μm
图6。
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小鼠诱导自噬早期但非晚期贝肯1过度表达逆转HD-like表型I。（A）总结AAV-m联合递送的实验工作流程高温涡轮增压器和AAV-贝肯1在不同的时间点。（B–E）WB和IHC分析验证成功贝肯1共注射m后过度表达HTT公司和贝肯1在不同的时间点交付。（n=4；每组4-4只动物）。（F–I）AAV共注入-贝肯1和AAV-mHTT公司降低了mHTT的聚集性，但仅在贝肯1-早期组。（n=20；每组4-4只动物）。（J–N）PPP1R1B蛋白水平在贝肯1-早期组与其他动物比较，用密度计和WB测量。（IHC组n=20只；每组4-4只，WB组n=4只；每组4~4只）***p<0.001**p<0.01*p<0.05；根据D'Agostino-Pearson综合正态性检验定义的正态分布，使用单向方差分析或非参数Kruskal-Wallis检验。所有数据均显示为平均值±SEM。WB值归一化为AAV-mHTT公司-注入表达水平并校正为ACTB值。密度测定值归一化为AAV-mHTT公司.比例尺：C-E为25μm，其余为50μm
图7。
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小鼠诱导自噬早期但非晚期贝克1过度表达逆转HD样表型II。（A–D）AAV后自噬标记物SQSTM1的表达水平降低-贝肯1联合注射。（n=6，对于mHTT公司-只有和贝肯1-早期，n=9贝肯1-迟到；每组4-4只动物）。注射后6周，任何动物组的LC3-II和LC3-II:LC3-I比率均未发生变化。（n=10，对于mHTT公司-只有和贝肯1-早期，n=12贝肯1-迟到；每组4-4只动物）。（E–L）SQSTM1的点大小和数量在贝肯1联合注射组与AAV-m组比较HTT公司-仅在6周后。（n=16，对于mHTT公司-只有和贝肯1-延迟，n=14贝肯1-早期；每组3至3只动物）。LC3点号在贝肯1-早期组与m组比较高温涡轮增压器-而LC3泪点的面积在所有组中是相似的。（n=15；每组3至3只动物）***p<0.001**p<0.01*p<0.05；根据D'Agostino-Pearson综合正态性检验定义的正态分布，使用单向方差分析或非参数Kruskal-Wallis检验。所有数据均显示为平均值±SEM。WB值归一化为AAV-mHTT公司-注入表达水平并校正为ACTB值。IHC值标准化为AAV-mHTT公司点号或面积。比例尺：25μm
图7。
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小鼠诱导自噬早期但非晚期贝肯1过度表达逆转HD样表型II。（A–D）AAV后自噬标记物SQSTM1的表达水平降低-贝肯1联合注射。（n=6，对于mHTT公司-只有和贝肯1-早期，n=9贝肯1-迟到；每组4-4只动物）。注射后6周，任何动物组的LC3-II和LC3-II:LC3-I比率均未发生变化。（对于m，n=10HTT公司-只有和贝肯1-早期，n=12贝克1-迟到；每组4-4只动物）。（E–L）SQSTM1的点大小和数量在贝肯1联合注射组与AAV-m组比较HTT公司-仅在6周后。（n=16，对于mHTT公司-只有和贝肯1-延迟，n=14贝肯1-早期；每组3至3只动物）。LC3点号在贝肯1-早期组与m组比较HTT公司-只有，而LC3点的面积在所有组中都是相似的。（n=15；每组3至3只动物）***p<0.001**p<0.01*p<0.05；根据D'Agostino-Pearson综合正态性检验定义的正态分布，使用单向方差分析或非参数Kruskal-Wallis检验。所有数据均显示为平均值±SEM。WB值归一化为AAV-mHTT公司-注入表达水平并校正为ACTB值。IHC值标准化为AAV-mHTT公司点号或面积。比例尺：25μm
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这项工作得到了瑞典研究委员会（#K2014-62X-22527-01-3和K2014-62-20404-08-5）、瑞典战略研究基金会（#FFL12-0074）、瑞典大脑基金会（#FO2014-0106）的资助；瑞典优秀项目-基底神经节疾病-林奈联盟（Bagadilico）、瑞典政府战略研究领域倡议（MultiPark&StemTherapy）、Stiftelsen Olle Engkvist Byggmästare（#186-655）、Thelma Zoéga医学研究基金（#TZ 2017-0057和TZ 2018-0052），Lars Hierta纪念基金会（#FO2017-0108和FO2018-0058）、Greta和Johan Kocks基金会（#2017/1852）、Tore Nilsons医学研究基金会，托尔斯滕和埃尔莎·塞格尔沃尔克基金会、安娜·利萨·罗森博格神经研究基金会和隆德皇家生理学会。