Mapping the Architecture of Ferret Brains at Single-Cell Resolution

doi:10.3389/fnins.2020.00322

.2020年4月15日14时322分。

doi:10.3389/fnins.2020.00322。 eCollection 2020。

以单细胞分辨率绘制雪貂大脑结构图

本·龙^1 2, 陶江³, 张建民^1 2, 陈思琪^1 2, 贾雪燕³, 徐晓峰^1 2, 罗清明^1 2, 慧功^1 2 3, 阿南·李^1 2 3, 李向宁^1 2 3

附属公司

¹武汉光电子国家实验室-华中科技大学生物医药光子学布里顿机会中心，中国武汉。
²华中科技大学工程学院生物医学光子学教育部重点实验室，武汉。
³华中科技大学苏州脑科研究所，JITRI脑科研究院，苏州，中国。

PMID： 32351352
预防性维修识别码：项目管理委员会7174703
内政部： 10.3389/fnins.2020.00322

以单细胞分辨率绘制雪貂大脑结构图

本·龙等。前神经科学. 2020.

.2020年4月15日14时322分。

doi:10.3389/fnins.2020.00322。 eCollection 2020。

作者

本·龙^1 2, 陶江³, 张建民^1 2, 陈思琪（Siqi Chen）^1 2, 贾雪艳³, 徐晓峰^1 2, 罗清明^1 2, 慧功^1 2 3, 阿南·李^1 2 3, 李向宁^1 2 3

附属公司

¹武汉光电子国家实验室-华中科技大学生物医药光子学布里顿机会中心，中国武汉。
²华中科技大学工程学院生物医学光子学教育部重点实验室，武汉。
³华中科技大学苏州脑科研究所，JITRI脑科研究院，苏州，中国。

PMID： 32351352
预防性维修识别码：项目管理委员会7174703
内政部： 10.3389/fnins.2020.00322

摘要

绘制整个大脑的细胞结构图可以揭示神经系统的组织逻辑。然而，这仍然是一个重大挑战，尤其是对于体积较大的脑回脑。在这里，我们提出了一种集成的管道，用于生成具有全脑单细胞分辨率的细胞结构图谱。为了分析大体积的大脑，我们使用改进的en-bloc Nissl染色方法对雪貂的大规模脑标本进行均匀染色(雪貂). 通过将全脑成像和大数据处理相结合，我们建立了在体素分辨率为0.33μm×0.33μm×1μm的情况下解析细胞构筑信息的策略和TB级数据分析。利用成年雪貂大脑的细胞结构数据集，我们鉴定了雪貂大脑中的巨型锥体神经元，并首次报道了它们的形态多样性、神经化学表型和在整个大脑中的三维分布模式。这条管道将促进对哺乳动物大脑组织和发育的研究，从啮齿动物到雪貂甚至灵长类的脑回。

关键词：细胞建筑学；en-bloc-Nissl染色；雪貂脑；巨大锥体神经元；单细胞分辨率；全脑成像。

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数字

图1
构建大规模大脑全脑细胞结构图谱的管道。**（A）**完整雪貂大脑的大体积内嵌Nissl染色和树脂包埋程序。比例尺，1厘米。**（B）**MOST系统的全脑成像和图像预处理。**（C）**基于三维U-Net卷积神经网络（CNN）的三维体细胞分割。使用经过训练的3D U-Net CNN识别和分割巨型PyN，并使用Imaris软件进行表面渲染，使用1800–2500μm表面积的彩条²和128μm×128μm x 128μm的三维数据块。**（D）**自动分割躯体或整个大脑的量化和3D可视化。**（E）**典型的en-bloc Nissl染色矢状面结果，位于右半球，从中线到外侧约2.30 mm（20μm厚）。比例尺，2 mm。**（F）**雪貂大脑新皮质层细胞构筑。可以清楚地区分第一层到第六层。从中的虚线框放大视图**（E）**.比例尺，100μm。**（G–J）**中框中的放大图像**（E）**整个大脑呈现均匀染色。比例尺，100μm。

图2
整个雪貂大脑数据集的连续冠状面和矢状面切片。**（A）**雪貂大脑背视图显示了序列冠状面和矢状面以及立体定位坐标的解剖位置（**B、 C类**); 颅骨的枕嵴被用作前后起源（Radtke-Schuller，2018）。**（B）**整个雪貂大脑的连续冠状切片，以及与枕嵴线的近似距离（从左到右的第一列到第三列；从前面到后面，厚度为20μm）。比例尺，3 mm。**（C）**整个雪貂大脑的连续矢状切片，以及与中线的大致距离（从左到右的第四列；中线到侧面，20μm厚）。比例尺，3 mm。

图3
来自雪貂大脑数据集的单细胞分辨率图像的高放大视图。**（A）**CGa区域双极细胞的放大图。比例尺，20μm。**（B）**DR细胞核的放大图（用白色虚线勾勒）。比例尺，100μm。**（C）**7n中纤维束的放大图。比例尺，40μm。**（D）**S1细胞结构的放大图；可以清楚地区分第I层至第VI层。比例尺，150μm。**（E）**S1中典型锥体神经元的高倍视图，如中的虚线框所示**（D）**.比例尺，50μm。**（F）**小脑第八小叶浦肯野细胞的放大图。比例尺，20μm。图2B、C中的所有放大图像均以虚线框表示。黄色和青色箭头分别表示尼塞尔染色细胞和树突/纤维束。7n，面神经；Cb，小脑；CGa，扣带回皮质，前部；DR，中缝背侧；S1，初级体感皮层；wm，白质。

图4
PSG雪貂初级运动皮层中的巨大PyNs。**（A）**在20μm最大强度投影（MIP）下，通过Nissl染色标记初级运动皮层中具有代表性的巨大PyNs。黑色和橙色箭头分别表示巨型PyN和其他PyN。比例尺，80μm。**（B）**雪貂运动皮层中巨大PyNs和其他PyNs的细胞体积。小提琴圆点图显示了巨大PyNs的细胞体积分布(n个=286个单元格）和其他PyN(n个=345个单元格）。彩色区域的宽度表示密度估计值；分散的点表示细胞体积值；红线代表PyNs的平均细胞体积（95%置信水平*****P（P）*< 0.0001; 双尾学生的t吨测试）。**（C）**基于细胞体积、平均灰度值和最长半径三个主要成分的巨型PyNs和其他细胞簇的3D散点图（K-means聚类）。**（D、E）**巨型PyNs为EAAC1阳性**（D）**和GAD67负极**（E）**神经元。蓝色荧光尼塞尔染色（第一列）和抗NeuN（第二列）、抗EAAC1（D）、和反GAD67（E）免疫标记显示（第三列）以及来自相应三个通道的合并图像（第四列）。白色箭头**（D、E）**分别表示NeuN+/EAAC1+和NeuN+/GAD67-PyNs；白色箭头表示NeuN+/GAD67+神经元。比例尺：100μm(**D、 E类**). 荧光-Nissl、蓝色荧光Nissl；M1，初级或皮层；PSG，乙状结肠后回。

图5
整个雪貂大脑中巨大PyNs的全脑分布。**（A）**使用NeuroGPS算法确定三维数据立方体中巨型PyN的位置；红色圆点表示128μm×128μm x 128μm三维数据立方体中巨大PyNs体细胞的中心。**（B）**巨型PyN自动定位的准确性(n个=每个大脑区域有5个数据块（512μm×512μm×512微米）。绿色和蓝色列分别表示召回和精度值。**（C）**在不同侧视图中对巨大PyN的大脑分布进行三维可视化。红点表示巨大PyNs躯体的中心。以雪貂大脑图谱（Radtke-Schuller，2018）和Nissl-cytoarchitectures为参考，绘制雪貂脑主要皮层区域的轮廓。**（D）**雪貂大脑区域的典型冠状面轮廓，以及**（C）**（背侧视图）显示冠状面的方向。**（E）**PSG（矢状面）雪貂运动皮质内巨大PyNs的二维视图。黑色箭头**（C）**（背视图）显示了矢状面的方向。比例尺，400μm。**（F–I）**巨大PyN分布的高倍视图，如所示**（D）**黄色箭头表示具有代表性的巨型PyN。比例尺，50μm。AEG，外侧脑回前部；乙状窦前回；镉，尾状核；CGa，扣带回皮质，前部；冠状回；crs，十字沟；cw，脑白质；dPFC，背前额叶皮层；LG，侧脑回；M1，初级运动皮层；MC，运动皮层；内侧外侧回；PMC，运动前皮层；PPc，顶叶后皮质，尾侧；PPr，顶叶后皮质，嘴侧部分；PSG，乙状结肠后回；S1-3，初级/次级/三级躯体感觉皮层；wm，白质。

图6
雪貂脑Betz细胞体形状的多样性。**（A）**四种Betz细胞体形状的表面绘制，包括金字塔形、纺锤形、扁平形和球形。**（B）**具有四种体型的Betz细胞体积。小提琴圆点图表示金字塔体体积分布(n个=93），纺锤形(n个=45），扁平(n个=118）和椭球(n个=30）Betz电池。彩色区域的宽度代表密度估计值；分散的点表示细胞体积；白线代表每种体型的平均细胞体积（95%置信水平***P（P）*<0.01*****P（P）*< 0.0001; Tukey的单向方差分析*事后（post-hoc）*测试）。**（C–F）**基于外部矩形轴比、最大横截面距离比和最大横截面轴比三个主要分量（定义见补充图S4B、C）生成的四种Betz细胞体形状的3D散点图。**（G）**四种体形脑宽分布的三维可视化。在体细胞自动定位过程中记录三维坐标，不同颜色的点代表四种体细胞形状的中心。

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