Silencing of microRNA-135b inhibits invasion, migration, and stemness of CD24+CD44+ pancreatic cancer stem cells through JADE-1-dependent AKT/mTOR pathway

doi:10.1186/s12935-020-01210-1

.2020年4月25:20:134。

doi:10.1186/s12935-020-01210-1。电子采集2020。

沉默microRNA-135b抑制CD24的侵袭、迁移和干细胞⁺CD44细胞⁺胰腺癌干细胞通过JADE-1依赖性AKT/mTOR途径

周景阳¹, 王海红（Haihong Wang）², 金汇车², 陆旭², 杨伟忠², 李云九², 婺源州²

附属机构

¹1中国南昌，330031，南昌大学医学院玛丽女王学院182班。
²中国江苏省徐州市鼓楼区环城路131号徐州市肿瘤医院肝胆外科，邮编：221000。

采购管理信息： 32351328
PMCID公司：项目管理委员会7183669
内政部： 10.1186/s12935-020-01210-1

沉默microRNA-135b抑制CD24的侵袭、迁移和干细胞⁺CD44细胞⁺胰腺癌干细胞通过JADE-1依赖的AKT/mTOR通路

周景阳等。癌细胞Int. 2020.

.2020年4月25:20:134。

doi:10.1186/s12935-020-01210-1。电子采集2020。

作者

周景阳¹, 王海红², 金汇车², 陆旭², 杨伟忠², 李云九², 婺源州²

附属机构

¹1中国南昌，330031，南昌大学医学院玛丽女王学院182班。
²中国江苏省徐州市鼓楼区环城路131号徐州市肿瘤医院肝胆外科，邮编：221000。

采购管理信息： 32351328
PMCID公司：项目管理委员会7183669
内政部： 10.1186/s12935-020-01210-1

摘要

背景：最近的研究强调了确定microRNAs（miRNAs）在胰腺癌（PC）发生和发展中作为关键调节因子的能力，胰腺癌仍然是最致命的恶性肿瘤之一，几乎没有有效的治疗方法。本研究旨在研究miR-135b的功能作用及其相关机制，以揭示胰腺癌干细胞（PCSCs）肿瘤生长的生物学特性。

方法：最初进行微阵列分析以确定与前列腺癌相关的miRNAs和基因。通过RT-qPCR和western blot分析分别检测miR-135b和PCSC标记在PC组织和细胞中的表达。双核糖核酸酶报告分析证实了可能与miR-135b结合的潜在基因（JADE-1）。为了研究PC细胞的致瘤性、迁移、侵袭和干性，进行了几个功能获得和功能丧失的遗传学实验。最后，在裸鼠体内进行肿瘤形成以确认体内结果。

结果：miR-135b在PC组织和PCSCs中高表达，并被鉴定为特异性靶向JADE-1。miR-135b的过度表达促进了PCSC的增殖、迁移和侵袭，抑制了细胞凋亡，并增加了干细胞相关因子（Sox-2、Oct-4、Nanog、Aldh1和Slug）的表达。此外，miR-135b可以促进AKT/mTOR通路中磷酸化AKT和磷酸化mTOR的表达。此外，miR-135b的过度表达加速了裸鼠肿瘤的生长。

结论：总之，miR-135b的沉默促进了JADE-1的表达，从而使AKT/mTOR通路失活，最终导致PCSC的自我更新和肿瘤生长受到抑制。因此，本研究有助于了解miR-135在PCSC中的作用及其潜在的分子机制，以帮助开发有效的PC治疗药物。

关键词：翡翠家族PHD手指1只；胰腺癌；雷帕霉素途径的蛋白激酶B/哺乳动物靶点；茎干；microRNA-135b。

©作者2020。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争性利益作者声明他们没有竞争性利益。

数字

图1
miR-135b在PCSC中高度表达。一PC miRNA数据集GSE41369中前20个差异miRNA表达的热图（横坐标表示样本数，纵坐标表示差异基因，右上角的直方图表示色阶，图中每个矩形对应一个样本表达值）；bPANC-1细胞中流分选阳性细胞的比例；C、 RT-qPCR检测miR-135b在细胞中的表达*第页 < 0.05与PANC-1组相比#第页 < 0.05与CD44⁺CD24型⁺组。测量数据表示为平均值 ± 标准偏差。未付费学生的t吨-测试用于比较两组之间的未配对数据。采用单向方差分析进行多组间的比较，然后进行Tukey的事后检验。实验重复3次

图2
miR-135b抑制可抑制PCSCs的存活、侵袭和迁移，并促进细胞凋亡。一采用CCK-8法检测PCSCs的活性。b流式细胞术检测PCSCs凋亡。**c（c）**Western blot分析检测凋亡蛋白的表达。d日通过软琼脂集落形成实验检测PCSCs的克隆能力。**e（电子）**用嗜酸粒细胞形成实验检测PCSCs（×400）的成球能力。**（f）**采用Transwell法检测PCSCs（×200）的迁移和侵袭。克Western blot分析和RT-qPCR检测肿瘤干细胞标记物的表达*第页 < 0.05与agomir-NC组相比；^#第页 < 0.05，与安替戈米NC组相比。测量数据表示为平均值 ± 标准偏差。采用单向方差分析进行多组间的比较，然后进行Tukey的事后检验。采用双向方差分析比较不同时间点多组间的细胞存活率数据。实验重复3次

图3
抑制miR-135b抑制体内肿瘤发生和肿瘤生长。一第30天肉眼观察肿瘤大小。b用游标卡尺测量裸鼠肿瘤体积。**c（c）**称重法测定裸鼠肿瘤质量；通过裸鼠成瘤实验检测PCSCs的致瘤性和生长。n个 = 6, *第页 < 0.05与agomir-NC组相比，^#第页 < 0.05 vs.antagomir-NC组；测量数据表示为平均值 ± 标准偏差。单因素方差分析用于多组之间的比较，然后进行Tukey的事后检验。重复测量方差分析用于比较多组在不同时间点的数据，然后进行Bonferroni事后检验

图4
JADE-1被预测为miR-135b的靶基因。一比较从DIANA、miRDB、miRWalk和mirDIP预测miR-135b靶基因的结果。b胰腺癌基因数据集GSE16515、GSE32676和GSE71989中下调表达基因的相似性和差异性。**c（c）**JADE-1是miR-135b的靶基因，也是胰腺癌的下调表达基因。d日,**e（电子）**前60个下调差异基因的GSE16515和GSE71989基因表达数据集的热图（横坐标表示样本数，纵坐标表示差异表达基因，右上角的直方图表示色阶，图中的每个矩形对应一个样本表达值）。**（f）**JADE-1在胰腺癌基因数据集GSE32676中的表达

图5
miR-135b特异性抑制JADE-1表达。一通过Targetscan分析miR-135b与JADE-1（别名PHF-17）3′UTR的结合位点。b采用双核糖核酸酶报告基因分析确定miR-135b和JADE-1之间的靶向关系(*第页 < 0.05 vs.agomir-NC组）；**c（c）**RT-qPCR检测各组PCSCs中JADE-1 mRNA的表达。d日western blot分析检测各组PCSCs中JADE-1蛋白的表达*第页 < 0.05与mimic-NC或antagomir-NC组相比，^#第页 < 0.05 vs.agomir-NC组。测量数据表示为平均值 ± 标准偏差。单因素方差分析用于多组之间的比较，然后进行Tukey的事后检验。实验重复3次

图6
western blot分析显示miR-135b通过抑制JADE-1促进AKT/mTOR通路的激活*第页 < 0.05与agomir-NC组相比；^#第页 < 0.05 vs.antagomir-NC组；^&第页 < 0.05 vs.sh-NC组；测量数据表示为平均值 ± 标准偏差。采用单向方差分析进行多组间的比较，然后进行Tukey的事后检验。实验重复3次

图7
miR-135b激活AKT/mTOR通路，促进细胞增殖并限制PCSCs的凋亡。一采用CCK-8检测PCSCs增殖情况。b流式细胞术检测细胞凋亡。**c（c）**Western blot分析检测凋亡蛋白的表达。d日采用克隆形成试验来测定PCSCs的活性。**e（电子）**采用Onco-球体形成实验检测PCSCs（×400）的成球能力。**（f）**应用Transwell检测PCSCs（×200）的迁移和侵袭。克Western blot分析和RT-qPCR检测肿瘤干细胞标记物的表达*第页 < 0.05 vs.sh-NC组；^#第页 < 0.05与DMSO组相比；^&第页 < 0.05与agomir-miR-135b + DMSO组。测量数据表示为平均值 ± 标准偏差。采用单向方差分析进行多组间的比较，然后进行Tukey的事后检验。采用双向方差分析比较不同时间点多组间的细胞存活率数据。重复测量方差分析用于比较多组在不同时间点的数据，然后进行Bonferroni事后检验。实验重复3次

图8
miR-135b激活AKT/mTOR通路以提高PCSC的致瘤性。一肿瘤大小的宏观观察。b用游标卡尺测量裸鼠肿瘤体积。**c（c）**称重法测定裸鼠肿瘤质量。d日免疫组化检测JADE-1、磷酸化AKT和磷酸化mTOR（×400）的阳性表达；n个 = 6, *第页 < 0.05与agomir-miR-135b + 毒死蜱组；^#第页 < 0.05 vs.antagomir-NC组；^&第页 < 0.05与agomir-miR-135b + DMSO组。n个 = 6.测量数据表示为平均值 ± 标准偏差。未付费学生的t吨-测试用于比较两组之间的未配对数据。重复测量方差分析用于比较多组在不同时间点的数据，然后进行Bonferroni事后检验

图9
JADE-1的miR-135b调节通过AKT/mTOR途径抑制癌干细胞和PC中肿瘤的生长。miR-135b可以促进PCSC在体内的球体形成、克隆、侵袭、迁移和肿瘤形成。其机制可能通过抑制JADE-1和激活AKT/mTOR通路来实现，从而影响PCSCs的干细胞，促进肿瘤生长

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