Comparative Application of BioID and TurboID for Protein-Proximity Biotinylation

doi:10.3390/cells9051070

比较研究

.2020年4月25日；9(5):1070.

doi:10.3390/cells9051070。

BioID和TurboID在蛋白质接近生物素化中的比较应用

丹尼尔·G·梅¹, 凯尔西·L·斯科特¹, 亚历山大·坎波斯², 凯尔·J·鲁^1 三

附属公司

¹Enabling Technologies Group，Sanford Research，Sioux Falls，SD 57104，美国。
²蛋白质组学设施，Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute，La Jolla，CA 92037，USA。
^三南达科他大学桑福德医学院儿科，苏福尔斯，SD 57105，美国。

采购管理信息： 32344865
预防性维修识别码：项目管理委员会7290721
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比较研究

BioID和TurboID在蛋白质接近生物素化中的比较应用

丹尼尔·G·梅等。细胞. 2020.

.2020年4月25日；9（5）:1070。

doi:10.3390/cells9051070。

作者

丹尼尔·G·梅¹, 凯尔西·L·斯科特¹, 亚历山大·坎波斯², 凯尔·J·鲁^1 三

附属公司

¹Enabling Technologies Group，Sanford Research，Sioux Falls，SD 57104，美国。
²蛋白质组学设施，Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute，La Jolla，CA 92037，USA。
^三美国南达科他大学桑福德医学院儿科，苏福尔斯，SD 57105。

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摘要

BioID是一种公认的识别蛋白质相互作用的方法，已在活细胞和几种动物模型中使用。然而，传统的标记周期需要15-18小时才能实现强大的生物素化，这对于某些应用可能并不理想。最近，使用BioID连接酶的定向进化开发了两种新连接酶TurboID和miniTurbo，并能够在与过量生物素孵育10分钟后产生强大的生物素化作用。然而，有报道担心生物素化的诱导性、细胞毒性和连接酶的稳定性。为了进一步研究TurboID的实际应用，并确定与BioID相比的优缺点，我们开发了几个表达BioID和TurboID融合蛋白的稳定细胞系，并通过免疫印迹、免疫荧光和基于生物素亲和纯化的蛋白质组学对其进行了分析。对于TurboID，我们观察到蛋白质不稳定、在缺乏外源生物素的情况下持续生物素化以及实际标记半径增加的迹象。然而，与BioID相比，TurboID在内质网腔内实现了强大的生物素化。通过结合多西环素诱导的表达和在缺乏生物素的培养基中的生长，可以诱导生物素化。这些研究应有助于使用基于BioID的方法的研究人员了解适合其特殊需求的连接酶和实验方案。

关键词：生物ID；TurboID；生物素化；层粘连蛋白；核孔复合体；邻近标记。

PubMed免责声明

利益冲突声明

Sanford Research已将BioID试剂授权给BioFront Technologies。资助者在研究设计中没有任何作用；收集、分析或解释数据；在撰写手稿时，或在决定公布结果时。

数字

图1
添加外源生物素可增加HA标记的BioID、TurboID和miniTurbo表达细胞中的生物素化。(A类)在不存在和存在外源生物素的情况下（18小时），通过WB分析稳定表达HA标记的BioID、TurboID或miniTurbo的A549细胞裂解物。抗-HA用于探测连接酶的表达，链霉亲和素-HRP用于探测生物素化。采用抗tubulin作为蛋白质负荷控制。(B)稳定表达HA标记的BioID、TurboID或miniTurbo的A549细胞的共聚焦图像，添加或不添加过量生物素18小时。使用抗-HA来可视化连接酶定位（红色），使用荧光共轭链霉亲和素来可视化生物素化（绿色）。使用赫斯特染料检测细胞核中的DNA（蓝色合并）。比例尺10µm。

图2
TurboID融合蛋白在不添加生物素的情况下以与添加生物素后的BioID融合蛋白质类似的水平添加生物素。在添加（+）50μM生物素18小时或不添加（-）生物素的情况下，通过western blot分析稳定表达BioID或TurboID标记的LaA、Nup43或Nup53融合蛋白的A549细胞的全细胞裂解物。用抗-HA检测融合蛋白水平，用链亲和素HRP检测生物素化。使用抗tubulin作为蛋白质负荷控制。

图3
在不添加外源生物素的情况下稳定表达TurboID LaA生物素酸盐的A549细胞。(A类)Western blot分析HA标记的BioID-LaA和TurboID-La融合蛋白表达（抗-HA）和整体生物素化（链霉亲和素HRP），在不添加生物素的情况下或在添加生物素10分钟或18小时后进行。使用抗tubulin作为蛋白质负荷对照。(B)稳定表达HA标记的BioID-LaA和TurboID-La的A549细胞的共焦图像。抗-HA用于可视化融合蛋白定位（红色）。在不添加生物素或添加生物素10分钟或18小时后，使用荧光偶联链霉亲和素检测生物素化。使用Hoechst染料检测细胞核中的DNA（蓝色合并）。比例尺10µm。

图4
LaA PPI候选物的下拉后蛋白质组分析。(A类)MS数据分析后，使用“检索/ID映射”工具将BioID和TurboID-LaA候选提交给UniProt，然后按亚细胞域命名进行分组。(B)候选人也被提交用于STRING分析可视化。

图5
Nup43-TurboID-HA和HA-TurboID-Nup53生物素酯，不添加生物素。(A类)在不添加或添加生物素的情况下（10分钟或18小时），对表达BioID或TurboID融合Nup43或Nup53的A549细胞裂解物进行Western blot分析。抗HA检测融合蛋白表达，链霉亲和素HRP检测生物素化。使用抗tubulin作为蛋白质负荷控制。(B,C类)BioID或TurboID Nup43和Nup53的共焦可视化。添加（10分钟或18小时）或不添加50µM生物素后，使用荧光共轭链霉亲和素来可视化生物素化（绿色）。抗-HA用于可视化融合蛋白的表达和定位（红色）。使用赫斯特染料检测细胞核中的DNA（蓝色合并）。比例尺10µm。

图6
Nup43和Nup53融合蛋白的实际标记半径比较示意图。(A类)Nup107-160复合体内Nup43-BioID和Nup43-TurboID的标记半径示意图。红色标记的强度与检测到的每个已识别蛋白质的归一化总百分比相关。(B)NPC内Nup43-BioID和Nup43-TurboID的标记半径示意图。蓝色标记的强度与检测到的每个已识别蛋白质的归一化总百分比相关。(C类)类似示意图(B)用于BioID-Nup53和TurboID-Nup53。

图7
TurboID-Nup53的主要候选药物在补充生物素之前进行生物素化。将每个连接酶和时间点的蛋白质ID提交给STRING数据库进行聚类可视化。

图8
在A549细胞中瞬时转染TurboID并不能提高生物素化的诱导率。(A类)通过WB分析瞬时转染HA-TurboID-NLS的A549细胞在有无生物素（10分钟）的情况下的表达（抗HA）和生物素化（链霉亲和素-HRP）。瞬时转染24小时后，将细胞暴露于生物素中10分钟。使用抗tubulin作为蛋白质负载控制。(B)转染HA-TurboID-NLS的A549细胞的表观荧光图像。用抗-HA检测蛋白质定位，用荧光偶联链霉亲和素观察生物素化。使用赫斯特染料检测细胞核中的DNA（蓝色合并）。比例尺10µm。

图9
通过结合dox诱导的TurboID表达和在缺乏生物素的培养基中的生长，可以实现诱导生物素化。在添加生物素之前，将稳定表达dox诱导的HA标记TurboID的A549细胞与多西环素和DMEM以及10%透析血清孵育18 h。然后将细胞与生物素孵育10分钟、1小时或4小时。使用链霉亲和素HRP观察生物素化水平。抗-HA用于观察融合蛋白水平。使用抗tubulin作为蛋白质负荷控制。

**图10**
TurboID在内质网腔内相对稳定，生物素化物比BioID更有效。(A类)在不存在或存在的情况下（10分钟、2小时或18小时），对稳定表达HA-TurboID或HA-TurbosID-Sun2的A549细胞进行Western blot分析。A549亲本细胞与生物素孵育18小时，作为基础生物素化水平的对照。(B)Sun2-BioID-HA在外源生物素化18小时后未显示生物素化，而Sun2-TurboID-HA在无和有过量生物素孵育（10分钟、2小时、18小时）的情况下显示了生物素化。用抗-HA（红色）可视化融合蛋白定位，用荧光偶联链霉亲和素（绿色）可视化生物素化。使用赫斯特染料检测细胞核中的DNA（蓝色合并）。比例尺10µm。

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