miR-615-3p promotes the epithelial-mesenchymal transition and metastasis of breast cancer by targeting PICK1/TGFBRI axis

doi:10.1186/s13046-020-01571-5

.2020年4月26日；39(1):71.

doi:10.1186/s13046-020-01571-5。

miR-615-3p通过靶向PICK1/TGFBRI轴促进乳腺癌上皮-间质转化和转移

薄磊¹, 王丹丹², 张明（Ming Zhang）¹, 邓玉伟³, 江慧杰⁴, 李一文⁵

附属公司

¹哈尔滨医科大学肿瘤医院乳腺外科，哈尔滨市哈平路150号，150086，中国。
²哈尔滨医科大学附属第二医院放射科，哈尔滨市学府路246号，150086，中国。
³哈尔滨医科大学附属第二医院肿瘤科，哈尔滨市学府路246号，150086，中国。
⁴哈尔滨医科大学附属第二医院放射科，哈尔滨市学府路246号，150086，中国。jianghuijie@hrbmu.edu.cn。
⁵哈尔滨医科大学附属第二医院肿瘤科，哈尔滨市学府路246号，150086，中国。zlylyw@126.com。

PMID： 32336285
预防性维修识别码： PMC7183699号
内政部： 10.1186/s13046-020-01571-5

miR-615-3p通过靶向PICK1/TGFBRI轴促进乳腺癌上皮-间质转化和转移

薄磊等。实验临床癌症研究杂志. 2020.

.2020年4月26日；39(1):71.

doi:10.1186/s13046-020-01571-5。

作者

薄磊¹, 王丹丹², 张明（Ming Zhang）¹, 邓玉伟³, 江慧杰⁴, 李一文⁵

附属公司

¹哈尔滨医科大学肿瘤医院乳腺外科，哈尔滨市哈平路150号，150086，中国。
²哈尔滨医科大学附属第二医院放射科，哈尔滨市学府路246号，150086，中国。
³哈尔滨医科大学附属第二医院肿瘤科，哈尔滨市学府路246号，150086，中国。
⁴哈尔滨医科大学附属第二医院放射科，哈尔滨市学府路246号，150086，中国。jianghuijie@hrbmu.edu.cn。
⁵哈尔滨医科大学附属第二医院肿瘤科，哈尔滨市学府路246号，150086，中国。zlylyw@126.com。

PMID： 32336285
预防性维修识别码： PMC7183699号
内政部： 10.1186/s13046-020-01571-5

摘要

背景：越来越多的证据表明，上皮-间充质转化（EMT）可以由微RNA（miRNAs）调节。miR-615-3p与肿瘤的发展有关。然而，miR-615-3p在乳腺癌转移中的作用尚不清楚。

方法：通过qRT-PCR和原位杂交检测miR-615-3p在乳腺癌细胞和组织中的表达。通过体外实验和小鼠模型评估miR-615-3p对肿瘤转移的影响。采用western blot和免疫荧光法检测EMT标记物。通过Western印迹、共免疫沉淀和萤光素酶测定分析了miR-615-3p在调节乳腺癌细胞转移中的分子机制。

结果：在本研究中，我们发现miR-615-3p在乳腺癌细胞和组织中显著升高，尤其是在那些有转移的细胞和组织。在乳腺癌细胞系中，miR-615-3p的稳定过表达足以促进体外细胞运动和体内肺转移，同时伴有上皮标记物表达减少和间充质标记物水平增加。进一步研究表明，miR-615-3p的重新引入通过靶向PICK1的3'-非翻译区（3'-UTR）增加了TGF-β的下游信号传导，即I型受体（TGFBRI）。PICK1抑制乳腺癌细胞中DICER1与Smad2/3的结合以及前miR-615-3p与成熟miR-615-3p的加工，从而产生负反馈回路。

结论：我们的数据强调了miR-615-3p在乳腺癌分子病因学中的重要作用，并暗示了其在癌症治疗中的潜在应用。

关键词：乳腺癌；EMT；PICK1；转化生长因子-β；miR-615-3页。

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利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
miR-615-3p水平在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中上调，并与乳腺癌细胞的转移能力呈正相关。(一)qRT-PCR分析30例乳腺癌患者的人类乳腺癌组织样本及其匹配的正常乳腺组织中miR-615-3p的表达。(b条)原位杂交分析miR-615-3p在人类乳腺癌组织和匹配正常组织中的表达（比例尺 = 100 μm）。(**c（c）**)miR-615-3p在转移性和非转移性组织中的相对表达（N（正常、无转移、转移） = 分别为51、31、20）。(d日)miR-615-3p的相对表达与乳腺癌临床分期进展（N（I，II，III，IV） = 分别为11、10、20、10）。(**e（电子）**)miR-615-3p在不同转移潜能的非癌人乳腺上皮细胞（MCF-10A）和乳腺癌细胞系（MCF-7、BT-549、MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞）中表达的qRT-PCR分析

图2
miR-615-3p通过EMT促进乳腺癌转移。一使用对照载体（NC）或异位miR-615-3p表达的Transwell分析法测量MCF-7细胞迁移（左侧）和侵袭（右侧）。b条使用对照载体（Anti-NC）或抗miR-615-3p表达的Transwell分析法测量MDA-MB-231细胞迁移（左侧）和侵袭（右侧）。**c（c）**代表性图像（左上面板）、H&E染色（左下面板）和肺转移瘤的转移结节数量（右面板）。异位miR-615-3p表达促进MCF-7细胞的肺转移（左表）。通过反义RNA敲低内源性miR-615-3p抑制MDA-MB-231细胞的肺转移（右图）。蛋白质印迹(d日左面板）和免疫荧光(**e（电子）**左面板））的MCF-7细胞具有控制载体（NC）或异位miR-615-3p表达。异位miR-615-3p下调上皮标记物E-cadherin，上调间充质标记物Vimentin。蛋白质印迹(d日右面板）和免疫荧光(**e（电子）**右面板）的MDA-MB-231细胞，带有对照载体（Anti-NC）或带有针对内源性miR-615-3p（Anti-miR-615-3p）的反义RNA。miR-615-3p敲除抑制EMT的诱导，如波形蛋白下调和E-cadherin上调所示。**（f）**图中显示了MCF-7（miR-615-p过度表达）和MDA-MB-231（抗miR-615-p）的转染效率

图3
miR-615-3p通过增强Smad2和Smad3的激活来促进TGF-β1诱导的乳腺癌细胞迁移。一MDA-MB-231细胞转染非特异性对照siRNA（Anti-NC）或miR-615-3p靶向siRNA（Anti-miR-615-3p），然后用TGF-β1（5 ng/ml）。用所示抗体对全细胞裂解物进行印迹。下面板直方图中列出的相对蛋白质水平**（a）**计算并比较（Student t检验）。b条用TGF-β1（5）处理转染对照质粒（NC）或miR-615-3p表达质粒的MCF-7细胞 ng/ml）适用于1 h.用所示抗体印迹全细胞裂解物。下面板直方图中列出的相对蛋白质水平(b条)计算并比较（Student t检验）。**c（c）**用非特异性对照siRNA（Anti-NC）或miR-615-3p-靶向siRNA（Anti-miR-615-3p）转染MDA-MB-231（左面板）细胞，用对照质粒（NC）或miR-615-5p表达质粒转染MCF-7细胞（右面板），在有无TGF-β1（5 纳克/毫升）。d日转染有指示试剂的MCF-7细胞在有无SB431542（10 μM）。列显示了三次独立实验的平均值。**e（电子）**用指示的试剂转染MCF-7和MDA-MB-231细胞，然后用指示的抗体印迹全细胞裂解物。图3右侧面板直方图中列出的相对蛋白质水平**e（电子）**计算并比较（学生t检验）

图4
PICK1是miR-615-3p的直接靶点。一实时PCR分析感染miR-615-3p表达载体或对照载体的MCF-7和T47D细胞中PICK1 mRNA水平。b条Western blot分析感染miR-615-3p表达载体或对照载体的MCF-7和T47D细胞中PICK1蛋白水平（上面板）。Western blot分析转染抗miR-615-3p或对照寡核苷酸的MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞中PICK1蛋白水平（下表）。**c（c）**PICK1的基因结构显示其3′-UTR中miR-615-3p的预测靶位点。d日将含有野生型（3′UTR-WT）或突变型（3’UTR-Mu）PICK1 3′-UTR的报告基因与miR-615-3p或对照载体、抗miR-615-3p或MDA-MB-231细胞中显示的对照寡核苷酸一起转染MCF-7细胞

图5
miR-615-3p过度表达和PICK1抑制产生类似的变化，这些变化通过PICK1体外异位表达得以恢复。(一)转染阴性对照（NC）、针对PICK1的siRNA和/或miR-615-3p、PICK1（缺乏3′UTR）后，进行MCF-7细胞的跨孔侵袭和迁移检测。(b条)如图所示转染MCF-7细胞的相差显微镜（比例尺，50 μm）。(**c（c）**)将PICK1 siRNAs转染MCF-7细胞，然后通过Western blot分析检测PICK1、E-cadherin、Vimentin、TβRI和TβRII蛋白水平（左侧面板）。Western blot分析用于确定PICK1敲除对MCF-7和T47D细胞（右两个面板）中TβRI和TβRII表达的影响。β-actin作为内部控制

图6
PICK1在人类乳腺癌组织中的表达及其与miR-615-3p表达的相关性。(一)人乳腺癌组织及相应非癌组织中PICK1水平的qRT-PCR分析(n个 = 21). (b条)乳腺癌组织中PICK1 mRNA水平的qRT-PCR分析 = 21）或不带（n = 21）淋巴转移。(**c（c）**)不同临床阶段乳腺癌患者PICK1 mRNA水平的qRT-PCR分析（WHO I，n个 = 11; WHO II，n个 = 20; 和WHO III，n = 11). (d日)低和高miR-615-3p水平乳腺癌患者PICK1 mRNA水平的qRT-PCR分析。采用Pearson相关分析PICK1与miR-615-3p之间的关系。(**e（电子）**)PICK1在正常和乳腺癌组织中的代表性IHC图像，具有不同的分数（100倍放大）。染色计分是通过强度*阳性细胞百分比获得的。IHC染色强度分级为0（无染色），1（弱染色 = 浅黄色），2（中度染色 = 黄棕色）和3（强染色 = 棕色）。一个区域内阳性染色肿瘤细胞的比例得分为小于5%，得分为0，5-20%得分为1，20-50%得分为2，50-75%得分为3 > 75%的人得了4分。(**（f）**)miR-615-3p水平高低的乳腺癌患者PICK1蛋白水平的IHC评分

图7
PICK1干扰SMAD2/3-DICER1复合物和pre-miR-615-3p的处理。一用PICK1或对照载体转染MDA-MB-231细胞，用SMAD2/3抗体（IP）或兔IgG（对照）免疫沉淀细胞裂解物。代表性图像显示PICK1、DICER1和SMAD2/3的IP和对照样品免疫印迹（IB）。输入：显示DICER1表达和β-肌动蛋白作为负荷对照的输入裂解物的代表性western blot。b条从IP中提取miRNA并进行qRT-PCR分析，以检测前miR-615-3p与DICER1和SMAD2/3的共沉淀。miR-615-3p前体蛋白的表达被标准化，并与相应的对照组相关联。**c（c）**qRT-PCR检测成熟miR-615-3p。d日正反馈回路的示意图。miR-615-3p通过抑制PICK1激活Smad2和Smad3信号。反过来，PICK1通过干扰SMAD2/3-DICER1复合物和miR-615-3p前体的处理下调miR-615-3p

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