Functional arrays of human pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues

doi:10.1038/s41598-020-62955-3

.2020年4月24日；10（1）：6919。

doi:10.1038/s41598-020-62955-3。

人类多能干细胞衍生心脏微问题的功能阵列

附属公司

¹加拿大安大略省多伦多市多伦多大学生物材料和生物医学工程研究所。
²加拿大安大略省多伦多市多伦多大学化学工程与应用化学系。
^三Amgen Discovery Research，美国加利福尼亚州南旧金山Amgen Inc。
⁴加拿大安大略省多伦多市CCRM。
⁵A2生物治疗公司，美国加利福尼亚州阿古拉山。
⁶加拿大安大略省多伦多市大学卫生网络麦考文再生医学中心。
⁷加拿大安大略省多伦多市多伦多大学机械与工业工程系。
⁸加拿大安大略省多伦多市多伦多大学生物化学系。
⁹加拿大安大略省多伦多市多伦多大学细胞与系统生物学。
¹⁰加拿大安大略省多伦多市多伦多大学特伦斯·唐纳利细胞和生物分子研究中心。
¹¹A2生物治疗公司，美国加利福尼亚州阿古拉山。Hxu@a2biotherapeutics.com。
¹²加拿大安大略省多伦多市多伦多大学生物材料和生物医学工程研究所。m.radisic@utoronto.ca。
¹³加拿大安大略省多伦多市多伦多大学化学工程与应用化学系。m.radisic@utoronto.ca。
¹⁴心脏与中风/加拿大安大略省多伦多市多伦多大学理查德·利瓦尔卓越中心。m.radisic@utoronto.ca。
¹⁵加拿大安大略省多伦多市多伦多大学生物材料和生物医学工程研究所。peter.zandstra@ubc.ca。
¹⁶加拿大安大略省多伦多市CCRM。peter.zandstra@ubc.ca。
¹⁷加拿大安大略省多伦多市多伦多大学泰伦斯·唐纳利细胞和生物分子研究中心。peter.zandstra@ubc.ca。
¹⁸加拿大不列颠哥伦比亚大学生物医学工程学院迈克尔·史密斯实验室。peter.zandstra@ubc.ca。

PMID： 32332814
预防性维修识别码： PMC7181791号
内政部： 10.1038/s41598-020-62955-3

人类多能干细胞衍生心脏微问题的功能阵列

尼玛兰·塔凡迪兰等。科学代表. 2020.

.2020年4月24日；10(1):6919.

doi:10.1038/s41598-020-62955-3。

附属公司

¹加拿大安大略省多伦多市多伦多大学生物材料和生物医学工程研究所。
²加拿大安大略省多伦多市多伦多大学化学工程与应用化学系。
^三Amgen Discovery Research，美国加利福尼亚州南旧金山Amgen Inc。
⁴加拿大安大略省多伦多市CCRM。
⁵A2生物治疗公司，美国加利福尼亚州阿古拉山。
⁶加拿大安大略省多伦多大学健康网络麦克尤恩再生医学中心。
⁷加拿大安大略省多伦多市多伦多大学机械与工业工程系。
⁸加拿大安大略省多伦多市多伦多大学生物化学系。
⁹加拿大安大略省多伦多市多伦多大学细胞与系统生物学。
¹⁰加拿大安大略省多伦多市多伦多大学特伦斯·唐纳利细胞和生物分子研究中心。
¹¹A2生物治疗公司，美国加利福尼亚州阿古拉山。Hxu@a2biotherapeutics.com。
¹²加拿大安大略省多伦多市多伦多大学生物材料和生物医学工程研究所。m.radisic@utoronto.ca。
¹³加拿大安大略省多伦多市多伦多大学化学工程与应用化学系。m.radisic@utoronto.ca。
¹⁴心脏与中风/加拿大安大略省多伦多市多伦多大学理查德·利瓦尔卓越中心。m.radisic@utoronto.ca。
¹⁵加拿大安大略省多伦多市多伦多大学生物材料和生物医学工程研究所。peter.zandstra@ubc.ca。
¹⁶加拿大安大略省多伦多市CCRM。peter.zandstra@ubc.ca。
¹⁷加拿大安大略省多伦多市多伦多大学泰伦斯·唐纳利细胞和生物分子研究中心。peter.zandstra@ubc.ca。
¹⁸加拿大不列颠哥伦比亚大学生物医学工程学院迈克尔·史密斯实验室。peter.zandstra@ubc.ca。

PMID： 32332814
预防性维修识别码： PMC7181791号
内政部： 10.1038/s41598-020-62955-3

摘要

为了加快心脏药物研发的进程，我们着手开发一个平台，该平台能够量化组织级功能，如收缩力，并适用于标准的多孔板操作。我们报告了一种基于96周的三维人多能干细胞（hPSC）衍生心脏微问题阵列，称为心脏微环（CaMiRi），该阵列位于能够测量收缩力的定制三维蛋白折叠多孔板中。在每个孔内，两个弹性微悬臂位于圆周斜坡上方。这些小孔中植入了细胞状胶原蛋白，随着圆周斜坡的逐渐倾斜，这些胶原蛋白在带尖端的微悬臂周围自组织，形成收缩的CaMiRi。使用悬臂的挠度测量和计算CaMiRi施加的收缩力。平台反应是稳健的，在各孔之间具有可比性，我们使用它来确定最佳组织配方。我们使用选定的具有已知效果的促心脏化合物验证了CaMiRi的收缩力反应。此外，我们开发了用于CaMiRi播种、图像采集和分析的自动化协议，以实现通过增加吞吐量测量收缩力。将hPSC衍生的心外膜细胞添加到系统中，证明了平台的独特组织制造特性以及对组织功能的后续影响。该平台代表了一个开源收缩力筛选系统，可用于药物筛选和组织工程应用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

N.T.、M.R.和P.W.Z是一项涉及心脏微组织形成设计的专利的共同发明人：“心脏组织结构及其制造方法”。N.T.和M.R.是一项专利的共同发明人，该专利涉及微问题形成的设计：“制造和使用三维组织系统的成分和方法”。C.H.、P.T.和H.L.是Amgen Inc.的员工。Amgen对心脏相关药物的发现感兴趣，并为本研究做出了贡献。H.X.、M.L.S.和M.E.M.是A2 Biotherapeutics Inc.的现任员工，而Amgen Inc.以前的员工对心脏相关药物的发现感兴趣。M.R.持有TARA生物系统公司的股权，并从该公司获得咨询收入，该公司利用心脏组织进行药物研发。

数字

图1
心脏微环（CaMiRi）平台的设计和制造。(A类)基板制造的工艺流程。该工艺从创建板材的三维计算机辅助设计（3DCAD）模型开始。然后使用Objet 30 Pro 3D打印机打印设计，以生成正模。然后创建一个负PDMS模具，随后创建一个互补的正PDMS模具。此正PDMS模具用于创建基于聚氨酯的负主模具，该模具可用于成型多个PDMS板。(B类)用于3D打印的板材的3D CAD模型（顶部面板）和实际的3D打印模具（底部面板）。比例尺代表20 毫米(C类)井的横截面，显示了细胞被移液管输送到的种子贮存器和用于力-位移测量的微悬臂（使用带有组织锚定点的力传感器（Micro-Squicker）进行经验校准，以固定微问题。比例尺代表1 毫米(D类)对组织锚的角度和长度进行测试，以确定最佳的锚几何形状。比例尺代表1 毫米(E类)用微型施力器测量悬臂的力-位移曲线。(F类)植入CaMiRi装置贮存器中的细胞胶原在24小时内重塑成围绕微悬臂梁的心脏组织小时。图中还显示了含有CaMiRi的96-well板的9口井。比例尺代表5 毫米(**G公司**)CaMiRi由一系列总输入细胞（25000、50000、100000和150000个细胞，每个孔播种。比例尺表示1 毫米(**H（H）**)CaMiRi的活/死染色。从左到右：亮场，细胞核为蓝色，活细胞为绿色，死细胞为红色。比例尺代表1 毫米。

图2
中央复合设计（CCD）-CaMiRi的知情配方(A类)在所有测试条件下，心脏微组织的收缩力（通过悬臂挠度测量），条件10产生的收缩力最高。数据来自三个独立实验，每个实验有三个重复，作为平均值±标准偏差。(B类)最优和最小最优条件下悬臂挠度的代表图。组织图像显示在明亮的区域。比例尺代表400 微米。

图3
CaMiRi的组织结构(A类)最低最佳条件7的全山CaMiRi免疫染色(B类)条件10，以及(C类)最佳条件。DAPI显示为蓝色，心肌肌钙蛋白T（cTnT）显示为绿色，波形蛋白显示为红色。中间行（ii）显示CaMiRi的放大倍数较高。最后一行（iii）显示cTnT为绿色，与白色箭头平行排列。比例尺代表400 微米，100 µm和50 µm，分别位于顶部、中部和底部行中的图像。

图4
CaMiRi对促心脏病药物和生长因子的反应。给药，组织培养20 收缩力测定前分钟。与车辆控制一起，高达5种药物浓度1 纳米，10 纳米，100 纳米，1 µm和10 μm。显示的数据是由于服用(A类)布利司他丁（阴性肌力）(B类)异丙肾上腺素（肌力异常阳性），以及(C类)硝苯地平（负性肌力异常），与溶媒对照组相比。数据来自三个独立实验，每个实验有三个重复，作为平均值±标准偏差*P（P） < 0.05.

图5
自动化CaMiRi成像和分析。(A类)在透射光下（左），在图像分析程序确定立柱后（中），以及在识别左立柱右边缘后（右），用2X物镜在分子器件Image Xpress Micro 4上完整成像。(B类)柱挠度随时间变化的Kymograph，记录输出参数的计算。(C类)使用自动脚本（y轴）计算的收缩幅度与在波形记录仪上执行的手动计算（x轴）之间的相关性。(**D、 E类**)自体CaMiRi对异丙肾上腺素（绿色）和利尿抑素（红色）的反应。单次试验的数据报告为中位数±中位数绝对偏差。

图6
探讨CaMiRi中心外膜细胞的作用(A类)心壁（包括心外膜、心肌和心内膜）的横截面示意图显示了构成心壁组织的细胞类型的复杂性。(B类)CaMiRi中hPSC-CM和心外膜细胞的空间组织和组织致密化（顶部面板为第0天，底部面板为第14天）。用0%（对照组）、5%、9%、20%和33%的心外膜部分制造组织。在灰度（每个面板的顶层）中，组织的明亮区域显示出来。绿色（中间层）代表hPSC-CM，红色（底部层）代表由hPSC衍生的心外膜细胞。比例尺表示1 毫米(C类)CaMiRi的收缩力读数由五种不同的心外膜细胞组分以及相关的cFB对照组组成。由33%心外膜部分组成的CaMiRi因压倒性张力而失效。数据来自四个独立实验，每个实验有两到四个重复，作为平均值±标准偏差*P（P） < 0.05.

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1. Thavandiran N，Nunes SSSS，Xiao Y，Radisic M。心脏分化和组装的拓扑和电气控制。干细胞研究与治疗。2013;4:14. doi:10.1186/scrt162。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Thavandiran N等。功能性多能干细胞衍生心脏微问题的设计和制定。美国国家科学院院刊。2013;110:E4698–E4707。doi:10.1073/pnas.131112010。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
1. Dengler J等。工程心脏组织能够研究心脏环境中残留的未分化胚胎干细胞的活性。生物技术与生物工程，2011年；108:704–719. doi:10.1002/bit.22987。-内政部-公共医学
1. Ungrin MD、Joshi C、Nica A、Bauwens C、Zandstra PW。从单细胞悬浮液衍生的人类胚胎干细胞聚集物中形成可复制的超高通量多细胞组织。《公共科学图书馆·综合》。2008;3:e1565。doi:10.1371/journal.pone.0001565。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[5] Thavandiran N等。功能性多能干细胞衍生心脏微问题的设计和制定。美国国家科学院院刊。2013;110:E4698–E4707。doi:10.1073/pnas.131112010。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[6] Thavandiran N等。功能性多能干细胞衍生心脏微问题的设计和制定。美国国家科学院院刊。2013;110:E4698–E4707。doi:10.1073/pnas.131112010。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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