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.2020年6月5:20:545-557。
doi:10.1016/j.omtn.2020.03.017。 Epub 2020年4月7日。

复发相关长非编码RNA LNAPPCC通过与PCDH7形成正反馈环促进结肠癌进展

Ting Li（李婷） 1, 李志强 2, 红星湾 2, 西凤汤 2, 韩旺（Han Wang） 三, 方才 4, 孟张（Meng Zhang） 5, 王宝春 6
附属公司

复发相关长非编码RNA LNAPPCC通过与PCDH7形成正反馈环促进结肠癌进展

Ting Li（李婷）等。 摩尔热核酸. .

摘要

长非编码RNA（lncRNAs）在许多恶性肿瘤中逐渐显示出重要的调节作用。然而，与结肠癌复发相关的lncRNA在很大程度上尚不清楚。在本研究中，我们使用GEO数据集搜索与结肠癌转移和复发相关的lncRNA。我们重点研究了一种与结肠癌预后不良相关的新型lncRNA长非编码RNA（LNAPPCC），该RNA在结肠癌中高度表达。LNAPPCC表达增加与结肠癌患者的转移、复发和不良生存率呈正相关。LNAPPCC促进结肠癌细胞增殖、迁移、体内异种移植生长和肝转移。机制研究表明，LNAPPCC结合EZH2，抑制EZH2-与PCDH7启动子的结合，下调PCDH7基因启动子组蛋白H3K27me3的水平，并激活PCDH7的表达。有趣的是，我们还发现PCDH7激活ERK/c-FOS信号，增加c-FOS与LNAPPCC启动子的结合，并激活LNAPPCC。因此，LNAPPCC和PCDH7通过EZH2和ERK/c-FOS形成一个正向调节环。结肠癌组织中LNAPPCC、PCDH7、磷酸化ERK和磷酸化c-FOS的表达之间存在正相关。此外，PCDH7的耗竭或ERK抑制剂的添加均消除了LNAPPCC在结肠癌中的致癌作用。总之，本研究确定了一种新的lncRNA LNAPPCC，它在结肠癌中高度表达，并与结肠癌患者的不良预后相关。LNAPPCC通过与PCDH7形成正反馈回路在结肠癌中发挥致癌作用。靶向LNAPPCC/EZH2/PCDH7/ERK/c-FOS信号轴是一种潜在的结肠癌治疗策略。

关键词：MAPK信号；PCDH7；结肠癌；反馈回路；长的非编码RNA。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
GSE37892数据中93例非转移性和37例转移性结肠癌组织中LNAPPCC（A）LNAPPCC-表达强度的表达模式和临床意义。通过Mann-Whitney试验，p=0.0059。（B） 根据GSE37892数据，LNAPPCC在73例II期和57例III期结肠癌组织中的表达强度。通过Mann-Whitney试验，p=0.0019。（C） 采用实时定量PCR方法检测62对结肠癌组织及癌旁正常组织中LNAPPCC的表达水平。通过Wilcoxon配对签名秩检验，p<0.0001。（D） 来自GSE39582数据的LNAPPCC表达强度与无复发生存率之间相关性的Kaplan-Meier生存分析。通过对数秩检验，n=577，p=0.0233。（E） GSE17536数据中LNAPPCC表达强度与总生存率之间相关性的Kaplan-Meier生存分析。通过对数秩检验，n=177，p=0.0137。（F） GSE17536数据中LNAPPCC表达强度与疾病特异性生存率之间相关性的Kaplan-Meier生存分析。通过对数秩检验，n=177，p=0.0005。（G） GSE17536数据中LNAPPCC表达强度与无复发生存率相关性的Kaplan-Meier生存分析。通过对数秩检验，n=145，p=0.0002。
图2
图2
LNAPPCC在结肠癌细胞增殖和迁移中的生物学作用（A）LNAPPCC-LNAPPCC的表达水平稳定地过表达并控制HCT116细胞。（B） LNAPPCC的表达水平稳定地过度表达并控制SW620细胞。（C） 通过CCK-8分析检测LNAPPCC稳定过度表达和对照HCT116细胞的细胞增殖。（D） CCK-8法检测LNAPPCC稳定过表达和对照SW620细胞的细胞增殖。（E） 通过EdU掺入法检测LNAPPCC稳定过表达和对照HCT116和SW620细胞的细胞增殖。比例尺代表100μm。（F） 采用Transwell迁移试验检测LNAPPCC稳定过表达和对照HCT116和SW620细胞的细胞迁移。比例尺代表100μm。（G） LNAPPCC的表达水平稳定沉默并控制HCT116细胞。（H） CCK-8法检测稳定沉默的LNAPPCC和对照HCT116细胞的增殖情况。（一） 用EdU掺入法检测稳定沉默的LNAPPCC和对照HCT116细胞的细胞增殖。比例尺代表100μm。（J） 采用Transwell迁移试验检测稳定沉默的LNAPPCC和对照HCT116细胞的细胞迁移。比例尺代表100μm。数据表示为基于至少三个独立生物重复的平均值±SD。*通过Student’s t检验（A-F）或单因素方差分析（ANOVA），然后进行Dunnett’s多重比较检验（G-J），得出p<0.05，***p<0.01，***p<0.05，***p<0.001，****p<0.0001。
图3
图3
结肠癌组织中PCDH7和LNAPPCC表达的相关性（A）GSE37892数据中93个非转移性和37个转移性结肠癌组织的PCDH7表达强度。通过Mann-Whitney检验，p=0.0121。（B） GSE37892数据中PCDH7和LNAPPCC表达强度之间的相关性。斯皮尔曼相关分析显示，n=130，r=0.7844，p<0.0001。（C） GSE17536数据中PCDH7和LNAPPCC表达强度之间的相关性。斯皮尔曼相关分析显示，n=177，r=0.6865，p<0.0001。（D） 根据GSE17536数据对PCDH7表达强度和总生存率之间的相关性进行Kaplan-Meier生存分析。通过对数秩检验，n=177，p=0.0056。（E） 根据GSE17536数据对PCDH7表达强度和疾病特异性生存率之间的相关性进行Kaplan-Meier生存分析。通过对数秩检验，n=177，p=0.0003。（F） 来自GSE17536数据的LNAPPCC表达强度与无复发生存率之间相关性的Kaplan-Meier生存分析。通过对数秩检验，n=145，p=0.0107。（G） GSE39582数据中PCDH7和LNAPPCC表达强度之间的相关性。斯皮尔曼相关分析显示，n=566，r=0.7268，p<0.0001。（H） 62例结肠癌组织中PCDH7和LNAPPCC表达水平的相关性。经Spearman相关分析，r=0.7308，p<0.0001。
图4
图4
LNAPPCC通过结合EZH2（A）RNA下拉分析激活PCDH7表达，使用生物素标记的LNAPPCC检测LNAPPCC-EZH2之间的相互作用。（B） 使用EZH2特异性抗体进行RIP测定以检测EZH2和LNAPPCC之间的结合。（C） 示意图概述了LNAPPCC中预测的富G基序，以及用于抗EZH2 RIP的野生型（WT）和突变LNAPPCC序列。LNAPPCC-Mut中删除了富G-基序。（D） 将LNAPPCC-WT或LNAPPCC-Mut过表达质粒瞬时转染HCT116细胞后，使用EZH2特异性抗体进行RIP分析。（E） 使用EZH2和H3K27me3特异性抗体在LNAPPCC中进行ChIP分析，稳定地过度表达并控制SW620细胞，以检测LNAPPCC-过度表达对EZH2-结合的影响PCDH7型启动子和H3K27me3水平PCDH7型发起人。（F） 使用EZH2和H3K27me3特异性抗体在稳定沉默的LNAPPCC和对照HCT116细胞中进行ChIP检测，以检测LNAPPCC-沉默对EZH2-结合的影响PCDH7型启动子和H3K27me3水平PCDH7型发起人。（G） 通过实时定量PCR和western blot检测LNAPPCC稳定过表达和对照HCT116细胞中PCDH7 mRNA和蛋白水平。（H） 通过实时定量PCR和western blot检测LNAPPCC稳定过表达和对照SW620细胞中PCDH7 mRNA和蛋白水平。（一） 通过实时定量PCR和western blot检测稳定沉默的LNAPPCC和对照HCT116细胞中PCDH7 mRNA和蛋白水平。数据表示为基于至少三个独立生物重复的平均值±SD。*通过Student t检验（B、D、E、G和H）或单因素方差分析（ANOVA），然后进行Dunnett多重比较检验（F和I），p<0.05，***p<0.01，***p<0.001，ns不显著。
图5
图5
PCDH7在结肠癌细胞增殖和迁移中的作用（A）PCDH7的表达水平在PCDH7中稳定过度表达并控制HCT116细胞。（B） 通过CCK-8测定检测稳定过表达的PCDH7和对照HCT116细胞的细胞增殖。（C） 用EdU掺入法检测PCDH7稳定过表达和对照HCT116细胞的细胞增殖。比例尺代表100μm。（D） 通过Transwell迁移试验检测稳定过度表达的PCDH7和对照HCT116细胞的细胞迁移。比例尺代表100μm。（E） PCDH7中PCDH7的表达水平稳定沉默并控制HCT116细胞。（F） CCK-8法检测稳定沉默的PCDH7和对照HCT116细胞的增殖。（G） 用EdU掺入法检测稳定沉默的PCDH7和对照HCT116细胞的细胞增殖。比例尺代表100μm。（H） 通过Transwell迁移测定检测稳定沉默的PCDH7和对照HCT116细胞的细胞迁移。比例尺代表100μm。数据表示为基于至少三个独立的生物重复的平均值±SD。**通过Student t检验（B–D）或单因素方差分析（ANOVA），然后进行Dunnett多重比较检验（F和H），p<0.01，***p<0.001。
图6
图6
PCDH7通过激活ERK/c-FOS信号转导（A）LNAPPCC在PCDH7稳定过表达和控制HCT116细胞中的表达水平上调LNAPPCC。（B） PCDH7中ERK和c-FOS磷酸化水平稳定过度表达并控制HCT116细胞。（C） C-FOS预测结合位点示意图LNAPPCC公司发起人。（D） 萤火虫荧光素酶报告子瞬时共转染后，含有LNAPPCC公司启动子、pRL-TK（编码肾素荧光素酶）和c-FOS过表达质粒进入HCT116细胞，进行双荧光素素酶报告分析。结果显示为萤火虫荧光素酶活性与肾盂荧光素酶活性的相对比率。（E） 使用c-FOS特异性抗体在稳定过度表达的PCDH7和对照HCT116细胞中进行ChIP检测，以检测PCDH7过度表达对c-FOS与HCT116结合的影响LNAPPCC公司发起人。（F） 用1μM GDC-0994处理48小时后，PCDH7中LNAPPCC的表达水平稳定地过度表达HCT116细胞。（G）LNAPPCC/PCDH7/ERK/c-FOS正反馈回路的示意模型。（H） 使用c-FOS特异性抗体在LNAPPCC中进行ChIP分析，稳定地过度表达并控制HCT116细胞，以检测LNAPPCC-过度表达对c-FOS与HCT116结合的影响LNAPPCC公司发起人。62例p-ERK染色强度强或弱的结肠癌组织中（I和J）LNAPPCC（I）和PCDH7（J）的表达水平。以p-ERK染色强度中位数作为临界值。通过Mann-Whitney试验，p=0.0081（I）和p=0.0093（J）。62例p-c-FOS染色强度强或弱的结肠癌组织中（K和L）LNAPPCC（K）和PCDH7（L）的表达水平。以中位p-c-FOS染色强度作为截止值。通过Mann-Whitney试验，p=0.0012（K）和p=0.0041（L）。对于（A）、（D）、（E）、（F）和（H），数据表示为基于至少三个独立生物重复的平均值±SD。*通过Student t检验（A、D、E和H）或单因素方差分析（ANOVA），然后进行Dunnett多重比较检验（F），p<0.05，***p<0.01，***p<0.001，ns不显著。
图7
图7
LNAPPCC在促进结肠癌细胞增殖和迁移中的作用取决于LNAPPCC/PCDH7/ERK/c-FOS反馈回路（A）通过CCK-8测定检测用1μM GDC-0994处理的LNAPPCC稳定过表达的HCT116细胞的细胞增殖。（B） 用EdU掺入法检测经1μM GDC-0994处理的LNAPPCC稳定过表达HCT116细胞的细胞增殖。比例尺代表100μm。（C） 用Transwell迁移试验检测经1μM GDC-0994处理的LNAPPCC稳定过表达HCT116细胞的细胞迁移。比例尺代表100μm。（D） LNAPPCC中PCDH7的表达水平稳定过表达，同时PCDH7稳定沉默HCT116细胞。（E） CCK-8分析检测LNAPPCC稳定过度表达和PCDH7稳定沉默HCT116细胞的细胞增殖。（F） 通过EdU掺入法检测LNAPPCC稳定过度表达和PCDH7稳定沉默HCT116细胞的细胞增殖。比例尺代表100μm。（G） 通过Transwell迁移测定检测LNAPPCC稳定过表达和同时PCDH7稳定沉默的HCT116细胞的细胞迁移。比例尺代表100μm。数据表示为基于至少三个独立的生物重复的平均值±SD。**采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验，p<0.01，***p<0.001，ns，不显著。
图8
图8
LNAPPCC促进结肠癌异种移植生长和肝转移（A）将LNAPPCC-稳定过度表达并同时稳定沉默的PCDH7 HCT116细胞皮下注射到裸鼠体内。每7天测量皮下肿瘤体积。（B） 在第28天测量皮下肿瘤重量第个注射后第二天。（C） 28岁时切除的皮下肿瘤图像第个注射后第天。（D） LNAPPCC和PCDH7在皮下肿瘤中的表达。（E） 皮下肿瘤Ki67 IHC染色。（F） 皮下肿瘤中的p-ERK IHC染色。（G） 皮下肿瘤中的p-c-FOS IHC染色。将（H–J）LNAPPCC稳定过表达并同时稳定沉默的PCDH7 HCT116细胞脾内注射到裸鼠体内。在35第个注射后第天，通过H&E染色检测指示结肠癌细胞的肝转移。比例尺代表1000μm。根据每组n=6只小鼠，数据以平均值±SD表示。*Kruskal-Wallis检验和Dunn多重比较检验表明，p<0.05，**p<0.01，ns不显著。
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参考文献

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