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.2020年4月15日12时33分。
doi:10.1186/s13098-020-00539-x。 eCollection 2020。

敲除lncRNA PVT1通过miR-23b-3p/WT1轴减轻高糖诱导的人系膜细胞增殖和纤维化

文忠 1, 曾娇娥 2, 薛俊丽 2, 杜爱民 2, 盐城徐 1
附属公司

敲除lncRNA PVT1通过miR-23b-3p/WT1轴减轻高糖诱导的人系膜细胞增殖和纤维化

文忠等。 糖尿病代谢综合征. .

摘要

背景：糖尿病肾病（DN）是1型和2型糖尿病的严重并发症。长非编码RNA（lncRNAs）被发现参与DN发病机制。在本研究中，我们旨在进一步探讨浆细胞瘤变异易位1（PVT1）在DN发病机制中的作用及其潜在机制。

方法：通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）评估PVT1、miR-23b-3p和Wilms肿瘤蛋白1（WT1）mRNA的表达水平。Western blot分析检测蛋白表达。使用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲基氧基苯基）-2-（4-磺苯基）-2检测细胞增殖H（H）-四唑仑（MTS）测定。miR-23b-3p与PVT1或WT1之间的靶向相关性通过双核糖核酸酶报告分析得到验证。

结果：PVT1和WT1在DN患者和高糖诱导的系膜细胞（MC）的血清中高表达。PVT1或WT1的敲除可改善HG诱导的MCs增殖和纤维化。从机制上讲，PVT1通过充当miR-23b-3p的分子海绵来调节WT1的表达。miR-23b-3p/WT1轴介导了PVT1敲低对HG诱导的MCs增殖和纤维化的保护作用。NF-κB通路参与HG诱导的MCs中PVT1/miR-23b-3p/WT1轴的调控网络。

结论：我们的研究表明，PVT1敲除通过调节miR-23b-3p/WT1/NF-κB通路，至少部分改善了HG诱导的MCs增殖和纤维化。靶向PVT1可能是DN治疗的潜在治疗策略。

关键词：DN；高糖；PVT1；WT1；miR-23b-3p。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争性利益作者声明他们没有竞争性利益。

数字

图1
图1
DN患者和HG诱导的MCs的血清中PVT1和WT1上调。应用qRT-PCR检测34例DN患者血清和30例健康对照血清中PVT1的表达(一)、HG诱导的MC(b条). 应用qRT-PCR检测34例DN患者血清样本和30例健康对照血清样本中WT1 mRNA的水平(c（c）)、HG诱导的MC(d日).e（电子）,如果western blot检测3份DN患者血清样本、3份正常血清样本、正常MCs和HG诱导的MCs中WT1的表达*P（P） < 0.05
图2
图2
HG诱导的MCs增殖和纤维化通过敲低PVT1而减轻。一通过qRT-PCR在转染si-NC、si-PVT1#1和si-PVT1#2的MCs中表达PVT1。将MCs暴露于45 mM HG或正常培养基中48 h，或在HG处理前转染si-NC或si-PVT1#1，然后在转染后0、1、2和3天通过MTS检测细胞增殖(b条)转染48 h后western blot检测Ki67的表达(c（c）)转染48 h后western blot检测α-SMA和FN水平(d日). *P（P） < 0.05
图3
图3
WT1敲除可消除HG诱导的MC增殖和纤维化。通过qRT-PCR检测WT1 mRNA的表达(一)western blot检测WT1蛋白水平(b条)在转染si-NC、si-WT1#1和si-WT2#2的MC中。在接触HG之前，用45 mM HG或正常培养基处理MCs 48 h，或转染si-NC或si-WT1#1，然后在转染后0、1、2和3天通过MTS检测细胞增殖(c（c）)转染48 h后western blot检测Ki67的表达(d日)转染48 h后western blot检测α-SMA和FN水平(e（电子）). *P（P） < 0.05
图4
图4
PVT1充当miR-23b-3p海绵，WT1是miR-23b-3p的直接靶点。一PVT1和WT1 3′-UTR中miR-23b-3p结合位点的示意图，以及突变的miR-23b-3p结合部位。b条用PVT1野生型萤光素酶报告质粒（PVT1-WT）、WT1 3′-UTR野生型报告构建体（WT1-WT）或靶序列的定点突变体（PVT1-MUT和WT1-MUT）以及miR-NC模拟物或miR-23b-3p模拟物转染的MC中的萤光素酶活性。c（c）通过qRT-PCR在转染PVT1过表达质粒或阴性质粒的MCs中表达PVT1。NC：阴性质粒，PVT1:PVT1过表达质粒。d日miR-23b-3p在转染si-NC、si-PVT1#1、PVT1过表达质粒或阴性质粒的MCs中的表达。NC：阴性质粒，PVT1:PVT1过表达质粒。用miR-NC模拟物、miR-23b-3p模拟物、抗miR-NC或抗miR-23b-3p引入MC，然后用qRT-PCR（E）测定miR-23b3p的表达，用qRT-PCR测定WT1 mRNA的表达(如果)western blot检测WT1蛋白水平(克).小时通过qRT-PCR在34份DN患者血清样本和30份健康对照血清样本中表达MiR-23b-3p*P（P） < 0.05
图5
图5
PVT1通过作为miR-23b-3p的ceRNA调节WT1的表达。用si-NC、si-PVT1#1和si-PVT1#1转染MCs + 抗miR-NC或si-PVT1#1 + 抗miR-23b-3p，然后通过qRT-PCR检测WT1 mRNA的表达(一)，通过蛋白质印迹检测WT1蛋白水平(b条). *P（P） < 0.05
图6
图6
PVT1敲除通过miR-23b-3p/WT1轴改善HG诱导的增殖和纤维化。用si-PVT1#1转染MCs + 抗miR-NC，si-PVT1#1 + 抗miR-23b-3p，si-PVT1#1 + pcDNA或si-PVT1#1 + HG治疗前WT1过表达质粒，然后通过MTS检测细胞增殖(一)western blot检测Ki67的表达(b条)western blot检测α-SMA和FN水平(c（c）). pcDNA：非靶向阴性质粒，WT1:WT1过表达质粒*P（P） < 0.05
图7
图7
NF-κB信号通路通过miR-23b-3p/WT1轴参与PVT1介导的HG诱导的MCs调控。一,b条western blot检测HG或正常培养基处理的MCs或si-PVT1#1转染的MCs中p65和p-p65的水平 + 抗miR-NC，si-PVT1#1 + 抗miR-23b-3p，si-PVT1#1 + pcDNA或si-PVT1#1 + HG治疗前WT1过表达质粒。pcDNA：非靶向阴性质粒，WT1:WT1过表达质粒*P（P） < 0.05
图8
图8
HG诱导的MC增殖和纤维化中PVT1/miR-23b-3p/WT1/NF-κB通路轴的示意模型。HG处理诱导MCs中PVT1表达。然后，PVT1的高表达抑制了miR-23-3p水平，从而保护了对WT1的抑制。接下来，NF-κB信号通路被激活。最后，NF-κB信号通路的激活增强了HG诱导的MCs的细胞增殖和纤维化，从而加速了DN的进展
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