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.2020年4月22日；17(1):31.
doi:10.1186/s12987-020-00192-6。

乳腺癌脑转移患者血清衍生因子改变人血脑屏障模型的通透性

卡罗琳·柯塔兹 1, 康斯坦斯·施密特 2, 萨西娅·卢琳·赫伯特 1, 乔纳斯·费尔德海姆 三, 尼古拉斯·施莱格尔 4, 法比安·戈塞莱 5, 卡斯滕·哈格曼 三, 诺伯特·荣威 2, 帕特里克·梅博姆 2, 阿奇姆·沃克尔 1, 马尔戈扎塔·布雷克 6
附属公司

乳腺癌脑转移患者血清衍生因子改变人血脑屏障模型的通透性

卡罗琳·柯塔兹等。 液体屏障CNS. .

摘要

背景：乳腺癌中最具威胁性的转移是脑转移，这与总体生存率很低相关，但也与生活质量有限有关。乳腺癌向大脑转移的一个关键事件是癌细胞跨越血脑屏障（BBB）的迁移。

方法：我们调整并验证了CD34+细胞衍生的体外人BBB模型（脑样内皮细胞，BLEC），用于分析患者血清对BBB特性的影响。我们收集了健康献血者、乳腺癌原发癌患者和乳腺癌骨、内脏或脑转移患者的血清样本。我们利用免疫分析法分析了这些血清中的细胞因子水平，并将其与临床数据相关联。我们使用细胞旁通透性测量、免疫荧光染色、Western blot和mRNA分析来检测患者血清对体外BBB特性的影响。

结果：在transwells中与脑周细胞一起培养的BLEC形成了一层紧密的单层，克劳丁-5在紧密连接处（TJ）定位正确。一些BBB标记蛋白，如TJ蛋白claudin-5和clodin、葡萄糖转运蛋白GLUT-1或外排泵PG-P和BCRP在这些培养物中上调。同时荧光素（400Da）的细胞旁通透性降低。然后我们使用该模型对患者血清进行治疗。只有脑转移乳腺癌患者的血清中细胞因子fractalkine（CX3CL1）和BCA-1（CXCL13）水平显著升高。fractalkine水平的增加与肿瘤的雌激素/孕激素受体状态有关。用这些血清治疗BLEC可选择性增加CXCL13和TJ蛋白闭塞素的表达。此外，血清治疗后荧光素的通透性增加。

结论：我们证明CD34+细胞衍生的人体外BBB模型可以作为研究脑血管病变的分子机制的工具。我们发现，脑转移患者的血清可能会影响体外血脑屏障的完整性，这与特定细胞因子如CX3CL1和CXCL13浓度升高有关。

关键词：血脑屏障；CX3CL1；CXCL13；体外模型；转移性乳腺癌。

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利益冲突声明

没有。

数字

图1
图1
与周细胞共同培养的BLEC形成紧密的屏障。CD34型+-衍生内皮细胞在transwell系统中单培养或与脑周细胞共培养6d。一Western blot显示，在共培养（co）和单培养（Mono）中诱导了所选BBB标记蛋白的表达。代表性条带下的数字表示归一化为β-肌动蛋白和单培养对照的蛋白质水平。b条CD34荧光素的细胞旁通透性+-衍生内皮细胞单层可以单独培养，也可以与周细胞一起培养。数据显示为平均值 ± 标准偏差（n = 3） ，***p < 0.001.c（c）claudin-5在CD34中的表达+-通过免疫荧光显示单独培养或与脑周细胞共同培养的衍生内皮细胞。放大×400，绿色：克劳丁-5，蓝色：DAPI核染色。d日用qPCR定量分析BLEC中转运体和紧密连接蛋白的信使RNA表达。目标基因表达被归一化为内源性控制，并显示为折叠控制，其任意设置为1（图中标记的控制水平）。数据显示为平均值 ± 三个实验的SD*第页 < 0.05与对照组相比具有统计学意义。BCRP公司乳腺癌抵抗蛋白（ABCG2），CLDN5号机组第5条，GLUT-1型葡萄糖转运蛋白1型（SLCA1），轻轨P1低密度脂蛋白受体相关蛋白1，MCT1型单羧酸转运体1（SLC16A1），MRP4型多药耐药相关蛋白4（ABCC4），OCLN公司闭塞素，P-GP公司P-糖蛋白1（ABCB1），愤怒晚期糖基化终产物受体（AGER），全要素生产率转铁蛋白受体（TFRC），ZO1公司闭塞带1（TJP1）
图2
图2
健康献血者和乳腺癌患者血清中细胞因子和趋化因子的血清水平。采用多分析免疫分析法检测以下组患者血清中的细胞因子和趋化因子：无癌患者（C）、原发性乳腺癌患者（PC）、乳腺癌患者内脏（VM）、骨（BM）和脑转移（CM）。数据以平均值表示 ± 扫描电镜*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001
图3
图3
不同雌激素和孕激素受体状态肿瘤患者的fractalkine血清浓度方框图。分形碱浓度值（pg/ml）以对数标度显示。急诊室雌激素受体，公共关系孕酮受体 < 0.05
图4
图4
经脑转移患者血清治疗的BLECS显示屏障性能降低。BLECS与脑周细胞在transwell系统中共培养6天。一用对照血清（C）和患有脑转移的乳腺癌患者的血清（CM）处理BLEC 24小时，然后测量荧光素的细胞旁渗透性。数据显示为平均值 ± 三个独立实验的SD，*p < 0.05.b条与周细胞共培养的BLEC中claudin-5的免疫染色，用健康供体（C）或乳腺癌脑转移患者（CM）的血清治疗。箭头表示使用CM乳腺癌患者血清治疗的BLEC紧密连接处的克劳丁-5染色缺失 = 6、放大倍数×400，绿色：克劳丁-5，蓝色：DAPI核染色。c（c）B中克劳丁-5连接完整的细胞定量。d日用对照血清和乳腺癌脑转移患者血清治疗的BLEC中趋化因子和BBB标记物的信使RNA表达。用qPCR定量mRNA。目标基因表达被归一化为内源性控制，并显示为折叠控制，其任意设置为1（图中标记的控制水平）。数据显示为平均值 ± n的SD = 4（对照血清）和n = 5（CM）**第页 < 与对照组相比，0.01具有统计学意义。C-X-C Motif趋化因子受体5（CXCR5）、C-X3-C Motif Chemokine受体1（CX3CR1）
图5
图5
重组BCA-1和fractalkine处理对BLEC的影响。一用指定浓度的BCA-1、fractalkine或两者的组合处理BLEC 24小时。使用MTT评估细胞活力。b条用指定浓度的BCA-1、fractalkine或两者的组合处理BLECS 24小时后，CLDN5和OCLN的信使RNA表达。目标基因表达被归一化为内源性控制，并显示为折叠控制，其任意设置为1（图中标记的控制水平）。数据显示为平均值 ± 标准偏差。c（c）用指示浓度的BCA-1、fractalkine（FKN）或两者的组合处理BLEC 24小时后，其荧光素的细胞旁通透性。数据显示为平均值 ± 标准偏差（n = 3). *第页 < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****磅 < 0.0001
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