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.2020年5月；56(5):1140-1151.
doi:10.3892/ijo.2020.5006。 Epub 2020年3月5日。

SORBS1通过抑制结直肠癌细胞株中的AHNAK发挥转移作用

吴卓秋（Woo-Cheol Cho） # 1, Jee-Eun Jang先生 # 2, Kyung-Hee Kim（金庆熙） 三, Byong-Chul Yoo公司 三, Ja-Lok Ku公司 1
附属公司

SORBS1通过抑制结直肠癌细胞株中的AHNAK发挥转移作用

吴卓秋（Woo-Cheol Cho）等。 国际癌症杂志. 2020年5月.

摘要

Cbl‑相关蛋白（CAP）由山梨素和SH3结构域包含1（SORBS1）基因编码。据报道，CAP通过与各种蛋白质的相互作用与肌动蛋白细胞骨架、受体酪氨酸激酶信号和细胞粘附相关。可以假设SORBS1具有许多未知功能，其中可能包括为转移提供有利条件。尽管CAP已被证明具有多种功能，但该蛋白的作用仅在代谢信号通路中有报道，其在癌症中的功能尚待阐明。在本研究中，通过逆转录定量PCR和western blot分析，在分为原发组和转移组的结直肠癌细胞系中检测到SORBS1的表达。此外，通过载体转染和慢病毒转导调控SORBS1的表达。通过评估SORBS1对细胞增殖和迁移的影响来确定其转移作用，并通过集落形成试验、细胞周期分析和Boyden小室试验来确定。为了阐明SORBS1‑结合蛋白，进行免疫沉淀。通过共焦显微镜鉴定SORBS1和AHNAK核蛋白（AHNAK）的共定位。值得注意的是，在SNU‑769A和SW480细胞中CAP的蛋白表达水平高于在SNU−769B和SW620细胞中。此外，与对照组相比，SORBS1‑过度表达组的菌落数量显著增加，这是通过菌落形成分析确定的；SORBS1过表达组形成的菌落数是对照组的8倍以上。与对照组相比，SORBS1过表达组的增殖能力在整个潜伏期内也显著增加。细胞迁移分析表明，与对照组相比，HCT‑116和SNU‑C4细胞系中迁移的SORBS1‑敲除细胞数量减少；HCT‑116和SNU‑C4细胞的迁移面积分别减少到31%和26%。因此，已证实SORBS1可以与AHNAK形成复合物，AHNAK通过抑制磷酸化的‑ERK和Rho‑相关的包含蛋白激酶1的卷曲线圈发挥抑癌作用。总之，SORBS1可能通过抑制AHNAK的表达而在肿瘤生长和迁移中发挥关键作用。

关键词：大肠癌；转移；山梨素和SH3结构域1；AHNAK核蛋白。

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数字

图1
图1
通过RT-PCR和western blotting分析SORBS1的表达。（A） 通过RT-PCR分析32个结直肠癌细胞株中SORBS1 mRNA的表达水平。（B） 用western blot分析20个结直肠癌细胞株中SORBS1蛋白的表达水平。逆转录PCR；SORBS1、sorbin和含有1。
图2
图2
SORBS1重组DNA的构建及其对HT29细胞生长的影响。（A） 编码人SORBS1基因的pcDNA3.1（+）载体的设计。（B） 用对照pcDNA3.1（+）载体和SORBS1重组DNA转染HT29细胞。western blot分析检测转基因细胞的蛋白表达水平。SORBS1被鉴定为94kDa的带。（C） 通过软琼脂试验观察SORBS1过度表达HT29细胞系的集落形成能力[HT29_对照，pcDNA3.1（+）载体转染HT29细胞；HT29_SORBS1，SORBS1-过度表达HT29]。培养3周后拍摄菌落图像。显示了具有代表性的图像。（D） 计算菌落数，结果显示为三个孔的平均菌落数。*P<0.05。SORBS1、山梨素和SH3结构域包含1。
图3
图3
SORBS1对细胞增殖和细胞周期进程的调节。（A） 在0、24、48、72和96 h时观察到SORBS1过度表达HT29细胞的增殖。重复实验三次后测量细胞数量。*与HT29_对照组相比，P<0.05。（B） 对SORBS1过度表达的HT29细胞进行细胞周期分析。*与HT29_对照组相比，P<0.05。（C） 在SW620细胞系中，用siRNA抑制SORBS1的表达。成功降低了SORBS1的表达。抑制SORBS1表达后，细胞增殖降低。*与对照组相比P＜0.05。siRNA，小干扰RNA；SORBS1、sorbin和含有1。
图4
图4
胰岛素对细胞增殖的影响。用200 nM胰岛素处理SORBS1过度表达的HT29稳定细胞系。（A） 胰岛素治疗后通过western blotting验证SORBS1的表达。（B） 胰岛素治疗后测量对照HT29细胞的增殖。（C） 胰岛素治疗后测量SORBS1过度表达HT29细胞的增殖。*与HT29_SORBS1相比，P<0.05。SORBS1、山梨素和SH3结构域包含1。
图5
图5
SORBS1抑制对癌细胞迁移的影响。为了比较对照组和SORBS1敲除组之间的迁移，使用了Boyden小室试验。细胞用无血清培养基接种在插入物的顶部，而完整的培养基放置在下面的培养箱中。迁移细胞穿过聚碳酸酯膜并粘附在嵌件底部。（A） 在HCT-116和SNU-C4细胞中证实了SORBS1的敲除。红色图像表示ImageJ分析的细胞。（B） HCT-116对照组；（C） HCT-116 SORBS1敲除组；（D） SNU-C4对照组；（E） SNU-C4 SORBS1敲除组。（F） SORBS1敲除降低HCT-116和SNU-C4细胞的迁移能力。*与对照组shRNA.sh，短发夹RNA相比P<0.05；SORBS1、山梨素和SH3结构域包含1。
图6
图6
内源性CAP和AHNAK的表达和亚细胞定位。共聚焦显微镜观察内源性CAP和AHNAK。在HCT-116对照组中，CAP和AHNAK位于细胞质中。CAP和AHNAK同时位于细胞质和细胞核中。细胞核（蓝色）；CAP（绿色）；AHNAK（红色）。AHNAK、AHNAK核蛋白；CAP、Cbl相关蛋白。
图7
图7
肿瘤转移相关蛋白对SORBS1敲除的反应。western blotting检测蛋白表达。用1mM二甲双胍处理细胞，2h后测量SORBS1相关蛋白的表达水平。（A）全细胞裂解物，（B）细胞质和核蛋白组分。AHNAK、AHNAK核蛋白；p、 磷酸化；ROCK1，Rho-相关的包含蛋白激酶1的卷曲线圈；sh，短发夹RNA；含SORBS1、SORBS和SH3结构域；总计1吨。
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