A selective p38α/β MAPK inhibitor alleviates neuropathology and cognitive impairment, and modulates microglia function in 5XFAD mouse

doi:10.1186/s13195-020-00617-2

.2020年4月21日；12(1):45.

doi:10.1186/s13195-020-00617-2。

选择性p38α/βMAPK抑制剂减轻5XFAD小鼠的神经病理学和认知障碍，并调节小胶质细胞功能

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¹韩国首尔，02447，东大汶谷，庆熙大学研究生院基础药学系，26 Kyungheedae-ro。
²韩国首尔东大汶谷庆熙大学研究生院生物医学科学与技术系，邮编：02447。
^三韩国首尔02447，东大门谷，庆熙大学研究生院生命与纳米药物科学系，26，Kyungheedae-ro。
⁴韩国首尔02447，东大门谷，庆熙大学研究生院生命与纳米药物科学系，26，Kyungheedae-ro。innks@khu.ac.kr。
⁵韩国首尔，02447，东大汶谷，庆熙大学研究生院基础药学系，26 Kyungheedae-ro。kimnj@khu.ac.kr。
⁶韩国首尔02447，东大门谷，庆熙大学研究生院生命与纳米药物科学系，26，Kyungheedae-ro。kimnj@khu.ac.kr。
⁷韩国首尔东大汶谷庆熙路26号庆熙大学药学院药学系，邮编：02447。kimnj@khu.ac.kr。
⁸韩国首尔，02447，东大汶谷，庆熙大学研究生院基础药学系，26 Kyungheedae-ro。jklee3984@khu.ac.kr。
⁹韩国首尔东大汶谷庆熙路26号庆熙大学药学院药学系，邮编：02447。jklee3984@khu.ac.kr。

PMID： 32317025
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选择性p38α/βMAPK抑制剂减轻5XFAD小鼠的神经病理学和认知障碍，并调节小胶质细胞功能

闵成吉（Min Sung Gee）等。阿尔茨海默病治疗. 2020.

.2020年4月21日；12(1):45.

doi:10.1186/s13195-020-00617-2。

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¹韩国首尔，02447，东大汶谷，庆熙大学研究生院基础药学系，26 Kyungheedae-ro。
²韩国首尔东大汶谷庆熙大学研究生院生物医学科学与技术系，邮编：02447。
^三韩国首尔02447，东大门谷，庆熙大学研究生院生命与纳米药物科学系，26，Kyungheedae-ro。
⁴韩国首尔02447，东大门谷，庆熙大学研究生院生命与纳米药物科学系，26，Kyungheedae-ro。innks@khu.ac.kr。
⁵韩国首尔，02447，东大汶谷，庆熙大学研究生院基础药学系，26 Kyungheedae-ro。kimnj@khu.ac.kr。
⁶韩国首尔02447，东大门谷，庆熙大学研究生院生命与纳米药物科学系，26，Kyungheedae-ro。kimnj@khu.ac.kr。
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⁸韩国首尔，02447，东大汶谷，庆熙大学研究生院基础药学系，26 Kyungheedae-ro。jklee3984@khu.ac.kr。
⁹韩国首尔东大汶谷庆熙路26号庆熙大学药学院药学系，邮编：02447。jklee3984@khu.ac.kr。

PMID： 32317025
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摘要

背景：慢性神经炎症、侵袭性β淀粉样蛋白（Aβ）沉积、神经元细胞丢失和认知功能障碍是阿尔茨海默病（AD）的病理表现。因此，解决神经炎症和抑制Aβ驱动的病理已被认为是AD治疗的重要策略。以往预防AD进展的研究已将p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）确定为AD治疗的一个有希望的靶点。最近的研究表明，药物抑制p38αMAPK可以改善AD小鼠模型的记忆障碍。

方法：在本研究中，我们使用AD小鼠模型5XFAD来探讨新型选择性p38α/βMAPK抑制剂NJK14047的治疗潜力。小鼠每隔一天注射2.5 mg/kg NJK14047或载体，持续3个月。进行Morris水迷宫任务和组织学成像分析。分别用免疫印迹法和qRT-PCR测定蛋白质和mRNA表达水平。采用MTT法和TUNEL法进行体外研究，以测量小胶质细胞和星形胶质细胞调节培养液对初级神经元的细胞毒性。

结果：NJK14047治疗下调9月龄5XFAD小鼠的磷酸化p38 MAPK水平，减少Aβ沉积量，并减少空间学习记忆丧失。当炎症前状态降低时，交替激活的小胶质标记物和小胶质吞噬细胞受体的表达增加。此外，NJK14047治疗减少了5XFAD小鼠大脑中荧光翡翠B标记的退化神经元的数量。体外研究进一步证实了NJK14047的神经保护作用。

结论：总之，选择性p38α/βMAPK抑制剂NJK14047成功地对5XFAD小鼠的AD表现出治疗作用。根据我们的数据，抑制p38 MAPK是AD治疗的一种潜在策略，表明NJK14047是针对p38 MAPKs的AD治疗的潜在候选药物之一。

关键词：阿尔茨海默病；淀粉样β；激酶抑制剂；小胶质细胞；P38丝裂原活化蛋白激酶。

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作者声明没有竞争性利益。

数字

图1
NJK14047治疗6至9 月龄降低磷酸化p38 MAPK水平并防止空间学习记忆障碍。一抑制NJK14047治疗的9月龄5XFAD小鼠皮层和海马中的p38 MAPK。磷-p38蛋白水平归一化为总p38水平，并显示为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 每组6个，单因素方差分析）。b条三组之间的Morris水迷宫任务：野生型、5XFAD和5XFAD+NJK14047。10分钟后探测任务中的典型游泳路径每组共10天的训练天数和逃逸潜伏期培训天数。数据显示为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 每组12–13人，GEE分析）。**c（c）**——**e（电子）**10之后经过几天的训练，对小鼠进行了一项探测任务。**c（c）**测量5XFAD组和5XFAD+NJK14047组之间的总游泳距离没有显著差异。d日在目标象限花费的时间**e（电子）**60s探针测试期间穿过目标区域的频率。数据显示为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 每组12–13，单因素方差分析）。^#*P（P）* < 0.05 vs.野生型**P（P）* < 0.05相对于5倍FAD

图2
NJK14047治疗6至9 月龄可以减少大脑皮层和海马体中的Aβ斑块。一,b条小鼠脑片共焦显微镜典型图像一硫黄素S染料和b条6E10抗体。定量每平方毫米硫黄素S-和6E10-阳性区域。为了量化，每个部分使用四个区域，每个小鼠使用四个部分。数据显示为平均值 ± SEM（比例尺 = 100 微米，n个 = 每组5个，单因素方差分析）。**c（c）**使用Aβ测定每个大脑皮层的Aβ蛋白水平和海马体重量（mg）_1–42ELISA法。数据显示为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 每组6名学生t吨测试）。^#*P（P）* < 0.05 vs.野生型**P（P）* < 0.05与5XFAD

图3
NJK14047治疗6至9 月龄不会影响淀粉样β前体蛋白的加工和降解分子。一参与Aβ生成的蛋白质的代表性免疫印迹图像和定量。使用皮层和海马的总蛋白裂解物，并用6E10、BACE1和PS1抗体进行免疫印迹。使用ImageJ量化蛋白质水平，并将其归一化为β-肌动蛋白水平。数据显示为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 每组5个，单因素方差分析）。b条参与Aβ消除的蛋白质的代表性免疫印迹图像和定量。使用皮层和海马的总蛋白裂解物，用IDE和NEP抗体进行免疫印迹。使用ImageJ进行定量分析。量化的蛋白质水平被归一化为β-肌动蛋白水平，并表示为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 每组5个，单因素方差分析）

图4
NJK14047治疗6至9 几个月大的孩子会下调大脑皮层和海马体的神经炎症。一,b条小鼠脑切片的典型共焦显微镜图像一Iba-1抗体标记小胶质细胞和b条标记星形胶质细胞的GFAP抗体。测量每平方毫米Iba-1和GFAP阳性细胞数。数据显示为平均值 ± SEM（比例尺 = 100 微米，n个 = 每组5个，单因素方差分析）。**c（c）**使用qRT-PCR测定M1和M2小胶质细胞标记物的相对mRNA表达水平。提取小鼠皮层和海马的总mRNA。mRNA表达水平根据GAPDH标准化，并表示为相对于SD对照组平均值的折叠变化(n个 = 每组5-6个，Kruskal-Wallis测试）。^#*P（P）* < 0.05 vs.野生型**P（P）* < 0.05与5XFAD

图5
NJK14047治疗6至9 月龄可上调小胶质细胞吞噬细胞受体的表达水平和小胶质细胞的Aβ清除功能。一用qRT-PCR测定皮层和海马小胶质吞噬细胞受体的相对mRNA表达水平。表达水平被标准化为GAPDH水平，并显示为相对于SD对照组平均值的折叠变化(n个 = 每组5-6个，Kruskal-Wallis测试）。b条用硫黄素S和Iba-1抗体染色的吞噬细胞小胶质细胞的典型共焦显微镜图像（比例尺 = 30 微米）。定量Aβ斑块20μm范围内的小胶质细胞计数。数据显示为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 每组5人，学生的t吨测试）。^#*P（P）* < 0.05 vs.野生型**P（P）* < 0.05与5XFAD

图6
NJK14047治疗6至9 月龄抑制皮层和海马的神经元死亡。一用Fluoro-Jade B染料染色的小鼠脑切片的典型共焦显微镜图像，用于标记皮层和海马的退化神经元（比例尺 = 100 微米）。b条对每只小鼠的四个切片和每个切片的四个区域进行定量分析。对每平方毫米的氟玉B阳性细胞进行定量。数据显示为平均值 ± 扫描电镜(n个 = 每组5个，单因素方差分析）。^#*P（P）* < 0.05 vs.野生型**P（P）* < 0.05与5XFAD

图7
NJK14047减轻LPS刺激的小胶质细胞系的神经毒性，而不是LPS刺激星形胶质细胞系。一实验方案。将小胶质细胞系BV2和星形胶质细胞系C8-D1A接种在6孔板上，5× 10⁵细胞/孔。用500刺激BV2和C8-D1A ng/ml LPS单独或2后用1或10预处理h 微米NJK14047。22岁之后 LPS刺激h后，将所有培养基换成新鲜的神经基础培养基，在此培养细胞24小时 h.收集条件培养液，处理接种在48周板上的初级神经元，进行细胞毒性试验(b条)或用于TUNEL分析的24孔盖玻璃(**c（c）**).b条BV2和C8-D1A条件培养基刺激小鼠初级神经元的存活率。外径570 nm归一化为对照组，并显示为对照平均值的百分比 ± 标准偏差(n个 = 3，Kruskal-Wallis试验）。**c（c）**用BV2和C8-D1A条件培养基刺激小鼠初级神经元的TUNEL分析。使用每个盖玻片中的四幅图像对凋亡细胞进行量化。数据显示为平均值 ± SEM（比例尺 = 100 微米，n个 = 5，单向方差分析）。^#*P（P）* < 0.05与对照组相比**P（P）* < 0.05与LPS组

图8
NJK14047降低LPS刺激的小胶质细胞神经毒性，而不是LPS刺激星形胶质细胞神经毒素。一实验方案。小鼠原代小胶质细胞和星形胶质细胞以5× 10⁵细胞/孔，刺激50 ng/ml LPS单独或2后用10预处理h μM NJK14047。22岁之后 LPS刺激h后，将所有培养基换成新鲜的神经基础培养基，在此培养细胞24小时 h.收集条件培养液，处理接种在24孔盖玻片上的初级神经元，用于TUNEL分析。b条MCM和ACM孵育24小时小鼠原代神经元的存活率高度外径570 nm归一化为对照组，并显示为对照平均值的百分比 ± 标准偏差(n个 = 3，Kruskal-Wallis试验）。**c（c）**用小鼠原代小胶质细胞和星形胶质细胞条件培养基刺激的小鼠原代神经元的TUNEL分析。使用每个盖玻片中的四幅图像对凋亡细胞进行量化。数据显示为平均值 ± SEM（比例尺 = 100 微米，n个 = 5，单向方差分析）。^#*P（P）* < 0.05与对照组相比**P（P）* < 0.05与LPS组

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1. Murphy议员，LeVine H.，第三次阿尔茨海默病和淀粉样β肽。阿尔茨海默病杂志。2010;19(1):311–323. doi:10.3233/JAD-2010-1221。-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学
1. Yang TT、Hsu CT、Kuo YM。人淀粉样β肽的细胞衍生可溶性低聚物扰乱细胞内稳态并诱导初级海马神经元凋亡。J神经传输。2009;116(12):1561–1569. doi:10.1007/s00702-009-0311-0。-DOI程序-公共医学

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[9] Yang TT、Hsu CT、Kuo YM。人淀粉样β肽的细胞衍生可溶性低聚物扰乱细胞内稳态并诱导初级海马神经元凋亡。J神经传输。2009;116(12):1561–1569. doi:10.1007/s00702-009-0311-0。-DOI程序-公共医学

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