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.2020年4月20日；11（4）:251。
doi:10.1038/s41419-020-2461-9。

Drp1通过Clec16a-、BAX-和GSH-通路调节缺血损伤中的线粒体功能障碍和代谢失调

段晨阳 1, 雷光（Lei Kuang） 1, 新明乡 1, 张杰 1, 于竺 1, 岳武 1, 青光岩 1, 刘良明（Liangming Liu） 2, 陶莉 三
附属公司

Drp1通过Clec16a-、BAX-和GSH-通路调节缺血损伤中的线粒体功能障碍和代谢失调

段晨阳等。 细胞死亡病. .

勘误表in

摘要

线粒体内稳态对缺血损伤的适应尚不完全清楚。在这里，我们研究了动态蛋白相关蛋白1（Drp1）在这一过程中的作用。我们发现，线粒体形态在缺血损伤早期发生改变，而线粒体功能障碍发生在缺血后期。Drp1似乎通过上调丝裂原-Clec16a抑制了有丝分裂，抑制了丝裂原蛋白的募集，并随后损害了缺血损伤后血管组织中自噬体的形成。此外，缺血诱导的Drp1激活通过诱导BAX线粒体易位，从而增加细胞色素C的释放，激活caspase-3/-9信号，从而促进凋亡。此外，Drp1介导代谢紊乱，并抑制线粒体谷胱甘肽的水平，以损害自由基清除，导致ROS的进一步增加和缺血性损伤后线粒体功能障碍的恶化。总之，我们的数据表明Drp1在缺血性损伤中起着关键作用。

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数字

图1
图1。缺血不同阶段与线粒体相关的分子通路。
一线粒体-DEGs在1 h和4 基于线粒体基因组微阵列的h缺血期。FDR值显示在火山图中，每个样品的DEG相对表达式显示在热图中。列出了相关的GSEA途径和GO ID编号。b条1的代表性中枢基因的Western blot和统计分析 h缺血期。c（c）4个基因的代表性中心基因的Western blot和统计分析 h缺血期。d日TEM（透射电子显微镜）图像观察1 h和4 h缺血期。（巴，400 纳米）。e（电子）共聚焦成像观察缺氧条件下VSMC线粒体形态1 h和4 h（63X_巴，25 微米）。定量分为三份，并分为三类：缩短线粒体、中间线粒体和延长线粒体，每组100个细胞得分*第页 < 0.05和**第页 < 与正常组相比为0.01。
图2
图2。线粒体功能障碍与VSMC缺氧后的自噬、凋亡和代谢过程密切相关。
一缺氧状态下VSMC中JC-1单体（绿色荧光探针）和JC-1聚集体（红色荧光探针）标记线粒体跨膜电位（Δψm）的典型共焦图像和统计分析 h和4 h（40X_巴，25 微米）。b条缺氧状态下VSMC中mPTP开口的典型共焦图像和统计分析，用钙黄绿素（绿色荧光探针）和MitoTracker®（红色）标记1 h和4 h（40X_巴，25 微米）。c（c）缺氧条件下VSMC ROS生成的典型共焦图像和统计分析 h和4 h（40X_bar，25 微米）。d日低氧条件下TUNEL结果的典型共焦图像和统计分析 h和4 h（20X_巴，100 微米）。e（电子）与自噬、凋亡、代谢相关的基因簇和筛选的线粒体相关基因簇之间的共表达网络*第页 < 0.05和**第页 < 与正常组相比为0.01。
图3
图3。正常和缺血条件下Drp1介导的生物途径的功能和途径富集分析。
一生理条件下Drp1介导生物途径的功能富集分析。b条缺血条件下Drp1介导的生物途径的功能富集分析。GO分析结果列在系列聚类数据的选定趋势之后。
图4
图4。Drp1通过Clec16a-Parkin通路参与缺血性损伤后的自噬。
一不同组（63X_bar，25 微米）。b条TEM图像代表不同组的自噬状态（bar，350 纳米）。c（c）WT或Drp1 KO小鼠4周后自噬相关蛋白的Western blot分析 缺血h，β-actin作为总水平和细胞质分数的内部参考蛋白，ANT作为线粒体分数的内部参照蛋白。d日蛋白质印迹结果的统计分析如图4C所示。e（电子）缺血损伤后Drp1介导的自噬途径示意图*第页 < 0.05和**第页 < 与正常样品中的WT相比为0.01。#第页 < 0.05和##第页 < 4后与WT相比为0.01 h缺血期。
图5
图5。Drp1影响缺血损伤后自噬体的形成。
一不同组转染GFP-LC3和LysoTracker®的VSMC的典型共焦图像（63X_bar，25 微米）。b条同位结果的统计分析见图5A。c（c）不同组VSMC线粒体自噬体和自溶体的典型共焦图像（63X_bar，25 微米）。d日同位结果的统计分析如图5C所示*第页 < 0.05和**第页 < 与正常组相比为0.01。#第页 < 0.05和##第页 < 与缺氧4小时组相比，0.01 小时。
图6
图6。Drp1通过促进BAX线粒体易位参与缺血损伤后的细胞凋亡。
一Drp1 shRNA（20X_bar，100）后低氧处理VMSC的TUNEL共焦图像和统计分析 微米）。b条Drp1 KO后不同组分BAX表达的Western blot分析。c（c）4天后WT或Drp1 KO小鼠中Drp1和BAX组合的Co-IP结果 h缺血期。d日不同组BAX、Drp1和线粒体共定位的典型共焦图像和统计分析。e（电子）4天后WT或Drp1 KO小鼠凋亡下游蛋白的Western blot分析 h缺血期*第页 < 0.05和**第页 < 与体外正常组或体内WT相比为0.01。#第页 < 0.05和##第页 < 与缺氧4小时组相比，0.01 体外h或体内缺血后WT。
图7
图7。Drp1通过抑制GSH清除自由基，参与缺血损伤后的细胞代谢紊乱。
一4天后血管组织的代谢组学热图 h缺血期。b条代谢分子和途径的代谢分类如图7A所示。背景色对应于图7A中的颜色条。c（c）24小时代谢笼检测监测Drp1 KO小鼠缺血后的耗氧量（VO2）。d日24小时代谢笼检测监测Drp1 KO小鼠缺血后的呼吸商。e（电子）24小时代谢笼检测监测Drp1 KO小鼠缺血后的能量代谢。（f）主成分分析（PCA）表明，四组之间存在显著差异，所有样本都在95%的置信区间内（霍特林T平方椭圆）。克正常和缺血条件下Drp1 KO后代谢途径富集气泡图。小时不同组的线粒体谷胱甘肽（GSH）和氧化谷胱甘素（GSSG）水平。我ROS和△在低氧处理的VSMC中干预Drp1和GSH后Ψm。j图7G的统计分析*第页 < 0.05和**第页 < 与体外正常组或体内WT相比为0.01。#第页 < 0.05和##第页 < 与缺氧4小时组相比，0.01 体外h或体内缺血后WT。
图8
图8。缺血损伤下Drp1调节自噬、凋亡和代谢途径的机制示意图。
Drp1在缺血性损伤后自噬、凋亡和代谢的调节中起着重要作用。（i） Drp1可能通过上调丝裂原-Clec16a，抑制丝裂原-蛋白激酶的募集，从而影响缺血损伤后血管组织中自噬体的形成，从而抑制有丝分裂。同样，自噬上调中的其他Drp1非依赖性途径也可能参与这一过程。（ii）缺血诱导的Drp1激活可能通过诱导BAX转位到线粒体从而促进凋亡，从而增加细胞色素C的释放和caspase-3/-9的激活。（iii）Drp1可能导致代谢紊乱，并在缺血损伤后抑制线粒体GSH水平，从而损害自由基清除，导致ROS进一步增加，△Ψm，缺血损伤后线粒体功能障碍加重。
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