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.2020年4月20日；11(1):1892.
doi:10.1038/s41467-020-15751-6。

1型肺炎球菌的致病性增加是由溶血素的快速自溶和释放引起的

劳拉·雅克 1, 斯塔夫罗斯·帕纳吉奥图 1, 穆里尔·巴尔塔扎尔 1, 马迪卡·森古尔 2, 沙迪娅·坎达克 1, 徐荣（音） 1, 劳拉·布里奇奥·莫雷诺 1, 玛丽·杨 1, 克里斯托弗·道森 三, 院长B Everett 4, 丹尼尔·尼尔 1, 阿拉斯·卡迪奥格鲁 5
附属公司

1型肺炎球菌的致病性增加是由溶血素的快速自溶和释放引起的

劳拉·雅克等。 国家公社. .

摘要

肺炎链球菌血清1型是撒哈拉以南非洲侵袭性肺炎球菌病的主要病因，但其侵袭性增加的机制尚不清楚。在这里，我们使用小鼠肺部感染模型来确定血清型-1（ST217）感染期间与严重细菌性肺炎相关的毒力因子。我们使用BALB/c小鼠，当感染其他血清型时，这些小鼠对肺炎球菌肺炎具有高度抵抗力。然而，当BALB/c小鼠经鼻感染ST217后，我们观察到24小时内100%的死亡率和高水平的菌血症。血清型1产生大量溶血素，由于细菌高度自溶而迅速释放。这会导致大量细胞毒性和细胞间紧密连接的破坏，从而使细菌从呼吸道快速传播到血液中。因此，我们的结果为血清型1侵袭性增加提供了一种解释。

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数字

图1
图1。BALB/c小鼠肺炎模型中血清1型（ST217S）和血清2型（D39）的比较。
一Kaplan–Meier生存曲线显示了1 × 106血清型1（ST217S）（红线）或血清型2（D39）（黑线）的菌落形成单位（CFU）。1只（ST217S）感染小鼠n个 = 9和2（D39）感染小鼠n个 = 10b条1只ST217S感染小鼠（红点）和2只D39感染小鼠（黑点）在1,3,6,12,18和24时的血液细菌负荷 鼻内感染后h（CFU/ml）。c（c）1只ST217S感染小鼠（红点）和2只D39感染小鼠（黑点）在1、3、6、12、18和24时的肺部细菌负荷 鼻内感染后h每mg CFU）（每个点代表一只小鼠）。数据如下：；每个符号代表一个单独的鼠标，几何平均值由水平条显示。使用双向方差分析和Sidaks后验进行统计分析***P（P）-价值 = 0.0001, ****P（P）-价值 < 0.0001. 源数据作为源数据文件提供。
图2
图2。血清型1（ST217）和血清型2（D39）肺炎链球菌感染小鼠肺炎期间的肺组织病理学。
如图1所示，小鼠被感染。感染小鼠的肺切片用苏木精和伊红染色，以显示18和24岁时肺炎球菌感染1（ST217S）或2（D39）时肺部病理学的变化 感染后h（5只小鼠/组/时间点）。幼年小鼠的肺切片(n个 = 5） 也显示了。比例尺 =  200 微米。
图3
图3。BALB/c小鼠鼻咽携带模型中血清型1（ST217S）和血清型2（D39）的比较。
小鼠通过鼻腔给药感染105CFU为1（ST217S）或2（D39），并在感染后0、1、3、7、14或21天扑杀。总共，每组挑选5-10只小鼠，取组织进行细菌负荷分析。数据如下：；每个符号代表一个单独的鼠标，错误条显示几何平均值。感染1（ST217S）的小鼠用红点表示，感染2（D39）的小鼠则用黑点表示。采用双向方差分析和Sidaks比较检验进行统计分析。一感染小鼠鼻咽中的CFU计数***P（P）价值 = 0.0008 (b条)感染小鼠嗅上皮中的CFU计数**P（P）价值 = 0.0025.c（c）感染小鼠嗅球中的CFU计数*P（P）价值 = 0.0341之间。d日感染小鼠大脑中的CFU计数*P（P）价值 = 0.0200, **P（P）价值 = 0.0070. 源数据作为源数据文件提供。
图4
图4。溶血素的产生和自溶率与肺炎球菌的毒力相关。
一小鼠感染1 × 106菌落形成单位)肺炎链球菌通过鼻腔给药并密切监测疾病的症状。如果感染小鼠变得昏昏欲睡，则将其扑杀，记录存活时间，并通过Miles和Misra稀释法测定血液中的CFU。与其他临床相关菌株（黑色）和表达ST217S溶血素的D39菌株（灰色）相比，感染非洲血清型1菌株（红色）的小鼠的存活时间（10只小鼠/组）。实验于168结束 h.使用单向方差分析和Dunnett的多重比较检验进行统计分析：****P（P）-价值 < 0.0001与D39。b条基于ELISA的不同菌株和血清型释放溶血素量的量化（107CFU）经青霉素/链霉素处理后溶解。数据表示为平均值 ± 所有血清型的扫描电镜n个 = 3个生物独立样品，而对于1个（ST217S）和2个（D39），n个 = 显示了6个（两个独立实验中的6个生物独立样本）。采用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验进行统计分析。星号代表与血清型2（D39）的显著差异*P（P） < 0.0132, **P（P） < 0.01, ****P（P） < 0.0001纳秒 = 不重要。c（c）细菌（OD6001.0）在37℃孵育 °C和175 转速为0.01%Triton®声波风廓线仪X，60 最小后处理OD600测量并转换为原始OD的百分比600正在读取。自溶百分比表示原始OD减少的百分比600正在读取。采用双向方差分析和Tukey多重比较检验进行统计分析。自溶率以三份为单位进行测量；数据表示为平均值 ± 星号表示血清1型与2型（D39）的比较，$表示血清1与5型的比较。（纳秒 = 不显著*P（P） = 0.0103,$$P（P） = 0.0056, ***P（P） = 0.0002, ****/$$$$P（P） < 0.0001). 源数据作为源数据文件提供。
图5
图5。感染剂量中的高浓度溶血素与BALB/c小鼠的高死亡率相关。
一在单独的管中，2 × 107在PBS中制备每毫升1（ST217S）、2（D39）、血清型5和PLN-A的CFU。剂量制剂在室温下培养60 在取下上清液样本并使用溶血素检测ELISA来量化每个菌株释放到上清液中的溶血素量之前的min。实验一式三份，误差条代表平均值 ± SEM。使用单向方差分析和Tukey多重比较测试进行统计分析。b条10种不同组合感染小鼠的存活时间6血清型1（ST217S）或血清型2（D39）的CFU肺炎链球菌50分之一 μl细菌剂量上清液在室温下培养60分钟 每组10只小鼠。对于一组小鼠，用脂质体（2 μg/ml胆固醇：鞘磷脂（66 mol/%胆固醇）和仅鞘磷脂脂质体）30 min.每个符号代表一只鼠标。误差条代表平均值 ± SEM。使用单向方差分析和Tukey的多重比较测试进行统计分析：*P（P）-价值 = 0.0398, **P（P）-价值 < 0.0093和****P（P）-价值 < 0.0001. 源数据作为源数据文件提供。
图6
图6。感染期间肺上皮细胞的细胞毒性水平因血清型而异。
A549肺上皮细胞感染6 × 105CFU（循环流化床）肺炎链球菌和，在6和12 感染后h，取出细胞培养上清液样本，并测量LDH（细胞毒性损伤指标）的量。在三个重复的微孔中进行感染，误差条代表平均值 ± 来自三个独立实验的SEM。从左至右的横线为非感染对照细胞（绿色）、感染血清型1（ST306）（水平横线）、感染2（D39）（黑色）、感染6B（虚线条）、感染5（对角条）、受感染7F（灰色方块条）和感染1（ST217S）（红色条）。白色条显示LDH阳性对照。使用双向方差分析和Dunnett的多重比较检验进行统计分析。源数据作为源数据文件提供。
图7
图7。非洲血清型1对上皮细胞屏障造成显著损害。
人原代肺泡上皮细胞（HPAEpiCs）在横穿插入物上培养3天以建立单层。总共10个5的cfu肺炎链球菌添加，并在6、12和24时读取跨上皮电阻读数（TEER） 感染后h评估上皮细胞之间紧密连接的损伤。白色条代表未受感染的控制井。一血清型1（ST217S）（红条）和血清型2（D39）（黑条）感染的比较****P（P）-价值 < 0.0001.b条5型（斜线条）和血清型1型（ST217S）之间的比较***P（P）-价值 = 0.0003, ****P（P）-价值 < 0.0001.c（c）血清型1（ST306）（横条）和血清型1的比较（ST217S）***P（P）-价值 = 0.0001, ****P（P）-价值 < 0.0001.d日血清型1（ST217S）（红色条）和血清型1的比较，添加脂质体（红色对角散列条）。清晰的斜线条表示仅用脂质体处理的细胞****P（P）-价值 < 0.0001. 从三个独立实验的重复孔中读取三份TEER读数。所有统计分析均采用双向方差分析和Tukey多重比较检验。误差条代表SEM。源数据以源数据文件的形式提供。
图8
图8。非洲血清型1导致人类原发性肺泡上皮细胞屏障通透性显著增加。
不同感染方式下上皮细胞屏障通透性变化的评估肺炎链球菌使用异硫氰酸荧光素（FITC）-右旋糖酐（70 千帕，1 mg/ml），详细信息见方法。白色条代表未经处理的细胞的FITC-葡聚糖排放。误差线代表平均值 ± SEM。使用双向方差分析和Tukey的多重比较测试进行统计分析。一血清型2（D39）（黑条）和血清型1（ST217S）（红条）FITC-Dextran激发发射的比较****P（P）-价值 < 0.0001.b条血清型5（对角散列条）和血清型1（ST217S）（红色条）之间FITC-Dextran激发发射的比较*P（P）-价值 = 0.0178, ***P（P）-价值 = 0.0007, ****P（P）-价值 < 0.0001.c（c）血清型1（ST306）（水平条）和1（ST217S）（红色条）之间FITC-Dextran激发发射的比较****P（P）-价值 < 0.0001.d日添加脂质体后血清型1（ST217S）感染（红色，对角散列条）和未添加脂质体（红色条）的FITC-Dextran激发发射的比较****P（P）-价值 < 0.0001. 作为对照，在没有细菌的情况下也用脂质体处理细胞（黑条，第二列）。源数据作为源数据文件提供。
图9
图9。肺炎球菌感染导致细胞紧密连接退化。
一人肺泡上皮细胞（HPAEpiC）的荧光图像，用抗闭塞小带抗体（ZO-1）染色。细胞共孵育12个 h，含磷酸盐缓冲液（PBS）、血清型2（D39）、血清类型1（序列型306）和血清型1（序列类型217)细菌细胞MOI–10:1。比例 = 50 微米。b条用抗ZO-1抗体标记的HPAEpiCs的校正总细胞荧光（CTCF）。通过从每个合并图像中选择六个细胞来计算CTCF。使用积分密度、细胞总面积和背景读数的平均荧光来获取总荧光。显示了三次重复实验的结果，误差条代表平均值 ± SEM。使用单向方差分析和Tukey多重比较测试进行统计分析：*P（P）-价值 =  0.0460和**P（P）价值 = 0.0045. 源数据作为源数据文件提供。
图10
图10。血清型1肺炎双球菌肺炎与血清型2感染的比较。
在血清型1（ST217/ST3081）感染的肺中，细菌裂解水平高，导致高浓度的毒素肺炎球菌溶血素的释放。这些高水平的溶血素会破坏上皮细胞之间的紧密连接，细胞毒性水平很高。肺上皮细胞屏障的继发损伤使血清1型肺炎球菌从肺部传播到血液中，并导致菌血症。其他原因引起的肺炎肺炎链球菌血清型如2型（D39），细菌溶解率较低，因此释放到肺部的溶血素浓度较低。这会降低细胞毒性，减少对肺部和血液之间细胞屏障的破坏，从而限制肺部内的细菌，因此不会发生菌血症。
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