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.2020年4月17日；11(4):239.
doi:10.1038/s41419-020-2431-2。

抑制BRD4通过NLRP3炎性体诱导的凋亡抑制肾癌增殖和上皮-间质转化

伊凡坦 1, 王敏（Min Wang） 2, 陈志远 3, 王磊（Lei Wang） 1, 刘秀红 1
附属公司

抑制BRD4通过NLRP3炎性体诱导的凋亡抑制肾癌增殖和上皮-间质转化

伊凡丹等。 细胞死亡疾病. .

摘要

BRD4长期以来参与许多不同的病理过程，特别是癌症和炎症的发展。焦下垂是一种新发现的炎症性程序性细胞死亡类型。然而，BRD4与肾细胞癌（RCC）中细胞凋亡之间的关系尚不明确。本研究表明，在RCC组织和细胞中，BRD4表达水平显著上调，而凋亡相关蛋白显著降低。通过基因敲低或使用溴结构域抑制剂JQ1抑制BRD4，在体外和体内阻止细胞增殖和上皮-间质转化（EMT）进展，并诱导RCC中胱天蛋白酶1依赖性pyroptosis。此外，BRD4抑制通过体外和体内的细胞凋亡抑制细胞增殖和EMT。此外，介导caspase-1依赖性凋亡的NLRP3在BRD4抑制后增加。此外，抑制BRD4可增强NLRP3的转录活性，而NF-κB磷酸化的激活可阻断NLRP3转录活性的增强，表明NF-κ的B是NLRP3上游的调节因子。总之，这些结果表明，BRD4抑制可阻止细胞增殖和EMT，并通过激活NF-κB-NLRP3-caspase-1凋亡信号通路在RCC中发挥抗肿瘤作用。因此，BRD4是RCC治疗的潜在靶点，JQ1有望成为该病的治疗剂。

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数字

图1
图1。肾癌组织标本和细胞系中Caspase-1和IL-1β的下调。
一肾癌（RCC）标本和邻近正常肾组织的苏木精和伊红染色。b条肾癌标本和邻近正常肾组织中caspase-1的免疫组织化学染色。c（c）肾细胞癌组织及邻近正常肾组织IL-1β的免疫组化分析。d日肾癌组织及周围正常区域caspase-1和IL-1β表达水平的Western blot分析。e（电子）用western blot分析HK-2细胞（人肾小管上皮细胞系）和5个RCC细胞系（A498、ACHN、CAKI-1、786-O和OSRC-2）中的相对caspase-1和IL-1β蛋白水平。结果显示为平均值 ± 标准偏差*P（P） < 0.05，相对于HK-2细胞系。
图2
图2。BRD4抑制抑制RCC细胞系的细胞增殖和EMT进展。
一使用CCK8分析评估转染BRD4靶向siRNA的786-O细胞的细胞增殖*P（P） < 0.05，相对于si-NC组。b条JQ1处理的ACHN细胞的细胞增殖（1.92、3.2、9.6、16、48、80、240、400、1.2、2、6、10、30和50 μM）用于48 使用CCK8分析测定h，以及相应的半最大抑制浓度（IC50)值已确定。c（c）不同浓度的JQ1处理0、24和48后ACHN细胞的细胞增殖 使用CCK8分析评估h*P（P） < 0.05与DMSO。d日转染si-BRD4或JQ1治疗48天后BRD4水平的Western blot分析 小时*P（P） < 0.05，相对于si-NC组或DMSO组。#P（P） < 0.05，相对于HK-2细胞。不适用。P（P） > 0.05与对照组。e（电子）,（f）转染siBRD4或经JQ1处理的786-O和ACHN细胞的集落形成能力，以及代表性图像*P（P） < 0.05与si-NC或DMSO。克通过western blotting检测转染siBRD4或JQ1处理的786-O和ACHN细胞中E-cadherin和vimentin的蛋白水平。实验一式三份*P（P） < 0.05与si-NC或DMSO。
图3
图3。BRD4抑制激活RCC细胞系中caspase-1依赖性凋亡。
一通过上述方法用LPS预处理786-O和ACHN细胞，然后分别用siBRD4转染或JQ1处理，并用ELISA法检测培养液中分泌的IL-1β水平。b条检测siBRD4转染和JQ1处理后caspase-1的活性。c（c）转染siBRD4或JQ1处理后786-O和ACHN细胞中caspase-1、IL-1β和GSDMD水平的Western blots。条形图显示了三个独立实验中caspase-1、IL-1β和GSDMD的相对水平。d–f786-O和ACHN细胞用50 24μM Ac-YVAD-CMK h、 然后用siBRD4转染或用JQ1处理。d日用ELISA法测定分泌到培养基中的IL-1β的产生。e（电子）在786-O和ACHN细胞中评估Caspase-1活性。（f）caspase-1、IL-1β和GSDMD水平的Western blot分析。条形图显示了三个独立实验中caspase-1和IL-1β的相对水平*P（P） < 0.05与对照组；#P（P） < 0.05 vs.si-BRD4或JQ1；不适用。P（P） > 0.05与对照组相比。
图4
图4。焦下垂激活介导BRD4抑制诱导的RCC细胞增殖和EMT抑制。
786-O细胞用50 μM Ac-YVAD-CMK或50 24μM Z-DEVD-FMK h、 然后转染siBRD4；ACHN细胞预处理50 μM Ac-YVAD-CMK或50 24μM Z-DEVD-FMK h、 然后用JQ1处理。一,d日使用CCK8测定法测量786-O和ACHN细胞的细胞增殖。b条,c（c）,e（电子）,（f）通过western blotting测定E-cadherin和vimentin的蛋白质水平，并将其归一化为GAPDH。实验一式三份*P（P） < 0.05与对照组；#P（P） < 0.05 vs.si-BRD4或JQ1；不适用。P（P） > 0.05与si-BRD4或JQ1。
图5
图5。JQ1通过小鼠的pyroptosis损害肿瘤生长和EMT进展。
将ACHN细胞皮下接种到裸鼠左侧。注射前，通过上述方法用LPS预处理细胞，然后用载体、JQ1或Ac-YVAD-CMK和JQ1的组合处理小鼠。一,b条异种移植瘤ki-67的免疫组织化学染色。使用Image-Pro Plus软件确定平均IOD。c（c）–e（电子）异种移植标本中BRD4和凋亡相关蛋白（如caspase-1和IL-1β）以及EMT相关蛋白（例如E-cadherin和vimentin）的Western blot分析*P（P） < 0.05与车辆；#P（P） < 与JQ1相比，0.05；不适用。P（P） > 与JQ1相比，0.05。
图6
图6。BRD4抑制调节NLRP3诱导的RCC细胞的凋亡、细胞增殖和EMT。
一,b条用NLRP3质粒或对照质粒转染786-O和ACHN细胞。western blotting检测NLRP3水平*P（P） < 0.05与对照质粒。c（c）–小时用si-NLRP3或si-NC转染786-O细胞，然后用si-BRD4转染。ACHN细胞用10 μM MCC950用于2 h、 然后用JQ1处理。c（c）,d日NLRP3蛋白水平的Western blot分析，以及来自三个独立实验的条形图。e（电子）,（f）Western blot分析指定组的caspase-1、IL-1β和GSDMD蛋白水平。克,小时对指定组的E-cadherin和Vimentin进行Western blot分析。实验一式三份*P（P） < 0.05与对照组；#P（P） < 0.05 vs.si-BRD4或JQ1；&P（P） < 0.05 vs.si-NLRP3或MCC950；Le-NC，控制质粒；Le-NLRP3，NLRP3质粒。
图7
图7。BRD4通过NF-κB途径调节NLRP3的表达。
用10 1纳克/毫升TNF-α 分别给药si-BDR4或JQ1前h。一,b条通过western blotting检测核因子κB、磷酸化NF-κB，IκBα和磷酸化IκB-α蛋白水平，并进行定量*P（P） < 0.05与对照组。#P（P） < 0.05 vs.肿瘤坏死因子-α。c（c）通过蛋白质印迹分析测量相对NLRP3蛋白水平，并进行定量*P（P） < 0.05与对照组；#P（P） < 0.05 vs.si-BRD4或JQ1；不适用。P（P） > 0.05与对照组。d日用10进行治疗后 1μM间隔11-7082 h、 测定细胞培养上清液中分泌的IL-1β水平和caspase-1活性*P（P） < 0.05与NC。e（电子）使用荧光素酶分析测定所示组中NLRP3启动子的活性。实验一式三份*P（P） < 0.05与对照组；#P（P） < 0.05 vs.si-BRD4或JQ1；不适用。P（P） > 0.05与对照组。
图8
图8。JQ1在体内诱导NLRP3表达并减弱NF-κB信号。
一通过蛋白质印迹法测定RCC异种移植肿瘤中磷酸化的NF-κB和NF-κB蛋白水平。对来自三个独立分析的数据进行量化。b条Western blot分析所示组的磷酸化IκBα和IκBα蛋白水平并进行量化。c（c）免疫印迹法检测NLRP3的表达*P（P） < 0.05与车辆；#P（P） < 与JQ1相比，0.05。
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