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.2020年4月15日；39(1):66.
doi:10.1186/s13046-020-01565-3。

PERK/NRF2和自噬是白血病干细胞抗G9a抑制的机制

Ji Eun Jang先生 1, Ju-In-Eom公司 2, Hai-Kyung Jeung公司 2, Haerim Chung公司 1, Yu Ri Kim（金玉日） 1, 金世祥（Jin Seok Kim） 1, June-Won Cheong先生 1, 尤洪敏（Yoo Hong Min） 三
附属公司

PERK/NRF2和自噬是白血病干细胞抗G9a抑制的机制

Ji Eun Jang先生等。 实验临床癌症研究杂志. .

摘要

背景：组蛋白甲基转移酶G9a最近被确定为急性髓细胞白血病（AML）表观遗传学治疗的潜在靶点。然而，G9a抑制对白血病干细胞（LSC）的影响尚不清楚，LSC是AML耐药和复发的原因。在本研究中，我们研究了LSC对G9a抑制的抵抗的潜在机制。

方法：我们评估了G9a抑制对AML和LSC样细胞系以及原代CD34中未折叠蛋白反应和自噬的影响+CD38型-AML患者的白血病细胞并研究其潜在机制。通过流式细胞术、western blotting、共焦显微镜、活性氧（ROS）生成测定评估治疗对细胞的影响。

结果：G9a抑制剂BIX-01294有效诱导AML细胞凋亡；然而，这种作用在KG1 LSC样细胞中是有限的。BIX-01294治疗或siRNA-介导的G9a敲除导致PERK/NRF2通路激活和KG1细胞HO-1上调。p38的磷酸化和细胞内活性氧（ROS）的产生受到抑制。药理学或siRNA介导的对PERK/NRF2通路的抑制协同增强了BIX-01294诱导的凋亡，HO-1表达受到抑制，p38磷酸化增加，ROS生成增加，表明激活的PERK/NRF2信号抑制了ROS诱导的KG1细胞凋亡。相比之下，用BIX-01294和PERK抑制剂共同处理正常造血干细胞没有显著的促凋亡作用。此外，G9a抑制诱导KG1细胞的自噬通量，而自噬抑制剂显著增加BIX-01294诱导的凋亡。PERK/NRF2抑制不能消除这种前存活自噬。

结论：PERK/NRF2信号传导在保护LSCs免受ROS诱导的细胞凋亡中发挥关键作用，从而赋予其对G9a抑制剂的抗性。用PERK/NRF2或自噬抑制剂治疗可以克服对G9a抑制的耐药性并消除LSC，这表明这些独特的靶向治疗AML的潜在临床效用。

关键词：自噬；G9a；白血病干细胞；PERK/NRF2；阻力。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
抑制白血病细胞和类LSC细胞中G9a的作用。一，流式细胞术分析，基于annexin V/PI排除，用BIX-01294治疗AML细胞和LSC样细胞48小时后凋亡细胞的分数 小时。b条经不同浓度BIX-01294处理24小时的KG1细胞中，H3K9和H3K27甲基化，通过western blotting分析 小时。c（c），蛋白质表达，用所示抗体进行western blotting分析，在KG1和U937细胞中用不同浓度的BIX-01294处理48小时 小时
图2
图2
通过抑制KG1 LSC-like细胞中的G9a诱导生前PERK信号。一，PERK途径蛋白的表达，通过western blotting分析，在用不同浓度的BIX-01294处理24小时的细胞中 小时。b条，蛋白质表达，用所示抗体进行免疫印迹分析，在转染G9a-靶向或对照siRNA的细胞中。c（c）流式细胞术分析在不存在或存在PERK抑制剂GSK2606414（20 μmol/L）48 小时。d日，通过流式细胞术测定用PERK靶向或对照siRNA转染细胞并用不同浓度的BIX-01294处理48小时后细胞的凋亡水平 小时。电子用15 48μmol/L BIX-01294 小时。（f），蛋白质表达，用所示抗体进行免疫印迹分析，在用BIX-01294（10 μmol/L），在没有或存在GSK2606414（20 μmol/L）48 小时。克流式细胞术测定Z-VAD-FMK（20 1 mmol/L） h，然后用BIX-01294（10 μmol/L）和GSK2606414（20 μmol/L）48 小时。小时流式细胞术测定转染G9a-靶向或对照siRNA并与GSK2606414（10）孵育的细胞中的凋亡水平 μmol/L）48 小时
图3
图3
AML LSC而非HSC对BIX-01294通过PERK抑制诱导的凋亡敏感。一CD34治疗后凋亡部分的流式细胞术分析，基于膜联蛋白-V/7-AAD排除+-用BIX-01294（5）富集16例原代AML细胞 μmol/L），在没有或存在GSK2606414（10 μmol/L）作用48 h.左侧面板：附件五+ 7-AAD公司+CD34型+细胞；右侧面板：CD34+CD38型−主要LSC。b条，基于膜联蛋白-V/7-AAD排除的流式细胞术分析，用BIX-01294治疗来自五个供体的正常HSC后的凋亡组分（5 μmol/L），在没有或存在GSK2606414（10 μmol/L）48 h.左侧面板：附件五+ 7-AAD公司+CD34型+细胞；右侧面板：CD34+CD38型−主要HSC。c（c），CD34的典型散点图+-浓缩的原代AML细胞
图4
图4
PERK抑制对BIX-01294诱导的ROS生成和ROS诱导的KG1 LSC-like细胞凋亡的影响。一，用流式细胞术测定BIX-01294（10 μmol/L），在没有或存在GSK2606414（20 μmol/L），用于16 小时。b条BIX-01294（10 μmol/L）和GSK260641（20 μmol/L），有/无NAC预培养（1 1 mmol/L） 小时。c（c）细胞经BIX-01294（10 μmol/L）和GSK2606414（20 μmol/L）48 h、 有/无NAC预孵育（1 1 mmol/L） 小时。d日用BIX-01294（10 μmol/L）和GSK2606414（20 μmol/L）48 h、 有/无NAC预孵育（1 mmol/L）用于1 小时
图5
图5
G9a抑制后KG1 LSC-like细胞中的PERK/NRF2/HO-1激活。一，用不同浓度的BIX-01294处理24小时后，通过蛋白质印迹分析NRF2和HO-1的表达 小时。b条用BIX-01294（10 μmol/L）。c（c）用BIX-01294（15 μmol/L）48 小时。d日，在用BIX-01294（10 μmol/L）48 小时。电子，用BIX-01294（10）处理细胞后，用流式细胞术测定凋亡分数 μmol/L） μmol/L）48 小时。（f）用不同浓度的BIX-01294处理NRF2 siRNA或对照siRNA转染细胞48天后，通过流式细胞仪测定细胞凋亡水平 小时
图6
图6
G9a抑制后，PERK途径诱导KG1 LSC-like细胞前存活自噬。一用BIX-01294（15 μmol/L），在没有或存在巴非霉素A1（BafA1）的情况下持续24小时 小时。b条、用BIX-01294（5）处理后GFP-LC3转染细胞的共焦显微镜图像 μmol/L）。c（c），用BIX-01294（15）处理细胞后，用流式细胞术测定凋亡分数 μmol/L） 毫摩尔/升）或BafA1（2 nmol/L），适用于48 小时。d日用BIX-01294（15 μmol/L）48 小时。电子用BIX-01294（10 μmol/L），在没有或存在GSK2606414（20 μmol/L）48 小时。（f）用BIX-01294（10 μmol/L）48 小时。克，细胞治疗48天后，通过流式细胞术评估凋亡水平 h带BIX-01294（10 μmol/L），在没有或存在PERK抑制剂GSK2606414（10 μmol/L）或自噬抑制剂3-MA（5 mmol/L）或BafA1（2 毫摩尔/升）。小时，用BIX-01294（10 μmol/L） 毫摩尔/升）或BafA1（2 毫摩尔/升）
图7
图7
图示LSC中G9a抑制的潜在影响
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