Novel plant microRNAs from broccoletti sprouts do not show cross-kingdom regulation of pancreatic cancer

doi:10.18632/oncotarget.27527

.2020年4月7日；11(14):1203-1217.

doi:10.18632/目标27527。

来自椰菜芽的新植物microRNAs不显示胰腺癌的跨王国调控

附属公司

¹德国海德堡大学普通外科、内脏外科和移植外科外科外科研究科分子肿瘤外科小组。
²这些作者为这部作品做出了同样的贡献，并分享了第一作者的身份。
^三德国曼海姆海德堡大学曼海姆医学院医学研究中心。
⁴这些作者为这部作品做出了同样的贡献，并分享了最后的作者身份。

PMID： 32292571
预防性维修识别码：项目管理委员会7147085
内政部： 10.18632/目标27527

来自椰菜芽的新植物microRNAs不显示胰腺癌的跨王国调控

习笑等。肿瘤靶点. 2020.

.2020年4月7日；11(14):1203-1217.

doi:10.18632/目标27527。

附属公司

¹德国海德堡大学普通、内脏和移植外科外科手术研究科分子肿瘤外科小组。
²这些作者为这部作品做出了同样的贡献，并分享了第一作者的身份。
^三德国曼海姆海德堡大学曼海姆医学院医学研究中心。
⁴这些作者为这部作品做出了同样的贡献，并分享了最后的作者身份。

PMID： 32292571
预防性维修识别码：项目管理委员会7147085
内政部： 10.18632/目标27527

摘要

食物来源的植物microRNA被建议通过“跨王国”调控来控制人类基因。我们检测了来自巴西甘蓝被称为brocoletti，广泛用作萝卜硫素补充剂，并评估了其对胰腺癌的影响。从4天龄的芽中分离出RNA，然后进行深度测序和生物信息学分析。我们在miRbase数据库中鉴定了2个新的和745个已知的植物microRNA序列，并预测了15494个人类靶基因和76747个推测的3'-UTR结合位点。最有希望的候选序列是已知的microRNA序列bra-miR156g-5p和新序列Myseq-330，这两个序列都预测了与凋亡相关的人类靶基因。脂肪感染导致的各寡核苷酸过度表达并没有改变胰腺癌细胞的生存能力、凋亡、克隆形成性、迁移或相关蛋白表达模式。这些数据表明，椰菜芽含有人类基因中具有假定结合位点的microRNA序列，但此处评估的序列并不影响癌症生长。我们的brocoletti衍生microRNA序列数据库为未来的分析提供了一个有价值的工具。

关键词：甘蓝；布罗科莱蒂；西兰花；跨国监管；植物microRNAs。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突作者就本手稿的出版没有任何利益冲突需要披露。

数字

**图1。卡通植物miRNA作用的最新发现。**
最近的研究表明，大米中的miR-168a、西兰花中的miR-159、金银花中的miR-2911、植物miR的混合物（-34a、-143和-145）、牛奶中的miR-29b和油菜安全通过胃肠道，可以在消费者的血流或组织中找到。植物源miRs在其他物种中的跨王国调节作用已被描述为：miR-168通过靶向低密度脂蛋白受体适配器蛋白（LDLRAP1）来清除低密度脂素；miR-159通过靶向转录因子7（TCF7）抑制乳腺癌生长；miR2911通过抑制病毒复制抑制病毒感染；植物miR混合物（-34a、-143和-145）通过一种未揭示的机制减少结肠肿瘤负担；miR-29靶向runt-related transcription factor 2（RUNX2）；miR-162a通过靶向mTOR调节蜜蜂种姓发育。

**图2。花椰菜芽中747个miR序列的鉴定。**
(A类)Broccoletti种子在烧杯中用无菌水培养，烧杯底部装有无菌棉花。这是一张4天大的芽的照片。(B类)从4天龄的芽中提取RNA，并通过深度测序鉴定broccoletti-miRs的序列。显示了从18个核苷酸到最大长度24的成熟broccoletti miR序列的长度与相应broccoletti miR的数量（数量）有关。最常见的是21、22或23个核苷酸的长度。(C类)选择顶级broccoletti-miR候选人的策略。我们执行了两种搜索策略：（I）通过文献检索鉴定莱菔硫烷相关（绿色）人类靶基因；（II）通过*生物信息学*人类靶基因中假定broccoletti-miR结合位点的分析。通过这种方式，我们确定了两种搜索策略共有42个人类基因，其数量（编号）显示在维恩图中。比例最高的组（31%）的靶基因在凋亡途径中起作用。确定了两个brocoletti-miR候选基因，即已知的bra-miR156g-5p和Myseq-330（类似于aly-miR166b-3p），这两个基因可能具有凋亡调节功能。

**图3。PDA细胞中broccoletti-miRs的脂质作用不会诱导靶基因的表达。**
(A类)BxPc-3和Bx-Gem细胞转染bra-miR156g-5p、Myseq-330、miR-D（各50 nM）或miR-NG寡核苷酸（各50 nM），作为模拟对照。转染后24小时，分离RNA，然后进行逆转录。样品由TaqMan验证^®miR测定。RNU44用于使表达水平正常化，模拟对照的平均折叠变化设置为1。给出了相对褶皱变化×1000。实验一式三份，数据显示为平均值±SD(^** *P（P）*< 0.01). (B类)脂肪感染后24小时从BxPc-3细胞中获取蛋白质，并对p53、XIAP、FoxO1、c-Myc、Akt1和caspase-3进行western blot分析。β-actin作为等负荷条件下的对照。蛋白质大小以千道尔顿（kD）表示。使用ImageJ测量谱带强度，并在谱带下方显示。将条带强度标准化为β-肌动蛋白。(C类)脂肪感染后24小时从BxPc-3细胞中获取总蛋白，并通过western blot分析评估PTK9蛋白水平，并如上所述进行检测。

**图4。顶级broccoletti-miR候选基因的脂质过氧化作用不会影响基础和诱导的细胞凋亡。**
(A类)如图3所示转染BxPc-3和Bx-Gem细胞。72小时后，用Annexin V-PE和7-AAD对细胞进行染色，然后进行FACS分析。显示了Annexin V-和7-AAD阳性细胞的百分比。(B类)用增殖标记物Ki-67（绿色）或凋亡标记物裂解的caspase-3片段（红色）的特异性抗体对脂包埋的BxPc-3和Bx-Gem细胞进行染色，以指示细胞凋亡。显示了放大倍数为100倍的典型图像。在18个视野中计算Ki-67-或caspase-3阳性细胞的百分比，平均值±SD如下图所示。(C类)如上所述对BxPc-3和Bx-Gem进行脂质体感染，24小时后，用吉西他滨（10 nM）处理细胞或不处理细胞。吉西他滨治疗96小时后，用MTT法测定生存率。数据以平均值±SD表示(^** *P（P）*< 0.01).

**图5。顶级brocoletti-miR候选基因的脂质作用不会改变细胞活力或形态。**
(A类)BxPc-3和Bx-Gem细胞要么用萝卜硫烷（SF，10μM）处理，要么不处理（CO）。此外，用浓度从1到100 nM的bra-miR156g-5p、Myseq-330、miR-D或miR-NC模拟对照物（50 nM）对细胞进行脂肪感染。72小时后，用MTT法测定存活率，数据表示为平均值±SD(B类)脂肪感染后24小时，用相控显微镜（50 nM broccoletti-miRs、miR-D或miR-NC模拟对照）拍摄BxPc-3细胞的形态。显示了放大倍率为×100和×200的典型图像。箭头表示凋亡性气泡。

**图6。顶级broccoletti-miR候选基因的脂代谢不影响克隆形成和迁移。**
(A类)如图3B所示，从BxPc-3细胞中获取蛋白质，并通过western blot分析检测Gli1、Shh、SUFU和Smoodned的表达。蛋白质大小以千道尔顿（kD）为单位显示，条带强度使用ImageJ测量，并显示在条带下方。带强度归一化为β-肌动蛋白。(B类)脂肪感染后24小时，以低密度（400个细胞/孔）重新接种BxPc-3和Bx-Gem细胞，并在常规培养基中培养2周。然后，将细胞固定并用考马斯染色，然后评估包含至少50个细胞的集落。模拟组中的菌落数设置为1。(C类)同样，在脂质体感染后24小时，将细胞接种到6孔板上并培养至90%融合。然后，用10μl移液管尖端在细胞层中间划出一条线。在放大×100倍的显微镜下评估并记录受伤区域的闭合情况。通过ImageJ软件计算间隙区域的大小。

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