Proteomic and functional analyses in disease models reveal CLN5 protein involvement in mitochondrial dysfunction

doi:10.1038/s41420-020-0250-y

.2020年3月30日：6:18。

doi:10.1038/s41420-020-0250-y。 eCollection 2020。

疾病模型的蛋白质组学和功能分析显示CLN5蛋白参与线粒体功能障碍

附属公司

¹意大利比萨IRCCS Stella Maris基金会神经变性和神经肌肉疾病分子医学部。
²2神经病学（儿童神经病学和神经病理学），意大利维罗纳大学神经科学、生物医学和运动系。
^三3医学、生物化学/发育生物学和HiLIFE，Meilahti临床蛋白质组学核心设施，芬兰赫尔辛基大学。
⁴4NEST，Scuola Normale Superiore，意大利比萨。
⁵意大利比萨科尼察比萨纳基金会。
⁶6意大利比萨CNR临床生理研究所（IFC）。
⁷第7章。I.芬兰库奥皮奥东芬兰大学维尔塔宁分子科学研究所。

PMID： 32257390
预防性维修识别码：项目管理委员会7105465
内政部： 10.1038/s41420-020-0250-y

疾病模型的蛋白质组学和功能分析显示CLN5蛋白参与线粒体功能障碍

斯特凡诺·多奇尼等。细胞死亡发现. 2020.

.2020年3月30日6:18。

doi:10.1038/s41420-020-0250-y。 eCollection 2020。

附属公司

¹意大利比萨IRCCS Stella Maris基金会神经变性和神经肌肉疾病分子医学部。
²2神经病学（儿童神经病学和神经病理学），意大利维罗纳维罗纳大学神经科学、生物医学和运动系。
^三3医学、生物化学/发育生物学和HiLIFE，Meilahti临床蛋白质组学核心设施，芬兰赫尔辛基大学。
⁴4NEST，Scuola Normale Superiore，意大利比萨。
⁵意大利比萨科尼察比萨纳基金会。
⁶6意大利比萨CNR临床生理研究所（IFC）。
⁷第7章。I.芬兰库奥皮奥东芬兰大学维塔宁分子科学研究所。

PMID： 32257390
预防性维修识别码：总经理7105465
内政部： 10.1038/s41420-020-0250-y

摘要

CLN5病是一种罕见的晚幼期神经元类蜡样脂褐质沉积症（NCL），由细胞内CLN5号机组编码蛋白质的基因，其主要功能和生理作用尚未解决。新出现的证据表明，线粒体功能障碍在几种形式的NCL的发病和进展中，为推测的生物标志物和共享的生物过程提供了新的见解。在这项工作中，我们采用了这种疾病的细胞和小鼠模型，以努力阐明与CLN5耗竭相关的疾病途径。采用以线粒体为中心的定量蛋白质组学方法，通过细胞生物学和免疫荧光分析进行功能验证，发现不同CLN5 KO细胞模型和氯离子5 ^- ^/-大脑皮层，与疾病进展密切相关。自噬机制的明显损伤，加上有丝分裂激活过程关键参数的改变，在功能上将CLN5蛋白与神经元损伤过程联系起来。通过将细胞器特异性蛋白质组的发现转化为CLN5患者的成纤维细胞，证实了人类CLN5疾病条件下细胞呼吸受损与有丝分裂途径激活之间的功能联系。我们的研究强调了CLN5参与有丝分裂活化和线粒体稳态，为CLN5疾病治疗的替代策略提供了新的见解。

关键词：神经系统疾病；蛋白质组学。

©作者2020。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突Alessandro Simonati获得了Bio-Marin Pharmaceutical，Inc和Neurogene Co的咨询酬金；其余的作者声明他们没有利益冲突。

数字

**图1。分析疾病模型中差异蛋白质组图谱的生物信息学检查。**
一左侧面板中的嵌套饼图描述了在*CLN5号机组*敲除细胞模型。显示量化线粒体蛋白质的数量，根据其高和中线粒体置信度进行选择（过滤器1）。只有这些线粒体蛋白，它们通过了差异折叠变化率的标准，FC > 1.5，基于使用≥2个独特肽和第页价值 ≤ Anova 0.05，（mtDEPs；过滤器2）作为生物信息调查的目标。右侧面板的火山图描绘了细胞模型中选定mtDEPs的蛋白质组剖面，显示了几种线粒体蛋白质的下调。b条类似的过滤策略也应用于*氯离子5* ^−/−鼠标模型（FC > 1.3，≥2个独特肽和第页Anova值≤0.05）。IPA典型途径分析的热图，根据疾病进展报告受影响最显著的途径。**c（c）**预测值最低的不同疾病模型中确定的受影响典型路径的条形图表示第页值。给出了分配给每个类别的线粒体DEPs的数量。

**图2。蛋白质组数据的功能和表达验证。**
一在HEK 293T和SH-SY5Y全细胞裂解液中评估与所选mtDEPs相关的蛋白表达水平的验证。密度分析证实了线粒体蛋白质组分析的结果。b条神经母细胞瘤细胞线粒体能量代谢分析*CLN5号机组*KO使用Seahorse XF Cell Mito应激试验显示，基础耗氧率和最大呼吸降低，而非线粒体呼吸无显著差异。**c（c）**分光光度法测定有症状小鼠大脑皮层中的RC酶显示，OXPHOS普遍受损，复合物III和I显著减少 + III和柠檬酸合成酶活性增加作为线粒体增殖的指标。数据表示三个独立实验的平均值（±标准偏差）(n个 = 9). 统计显著性由双尾学生确定t吨测试*第页 < 0.05; **第页 < 0.01***第页 < 0.001.

**图3。CLN5细胞模型中有丝分裂相关参数的分析。**
一SH-SY5Y KO模型中的线粒体网络组织。与空矢量控制线相比，*CLN5号机组*在Mitotracker红和VDAC染色后，KO细胞显示线粒体网络改变，碎片增加。MT红色CMXRos探针积累取决于膜电位，在KO线中减少，表明ΔΨm减小。图中显示了三种独立细胞染色的代表性图像。比例尺，10 微米。插入显示3倍放大。b条神经母细胞瘤细胞用TMRM探针染色，结果显示*CLN5号机组*KO线a在探针积累和膜电位维持方面降低了线粒体膜电位。端点分析显示KO细胞线粒体膜去极化，报告为平均TMRM相对荧光单位RFU ± SD减去与FCCP处理相关的荧光。通过DAPI染色将数据归一化为细胞数量的函数。动力学轨迹表明，KO和对照细胞之间有差异能力维持线粒体膜极化，特别是在寡霉素阻断质子通过复合物V转运后，突显出线粒体内膜的任何泄漏。在实验结束时加入FCCP，使线粒体完全去极化，以证明所获得测量的特异性。**c（c）**使用荧光染料H2DCFDA，缺乏CLN5的细胞的氧化还原状态显示SH-SY5Y中的ROS量显著增加*CLN5号机组*KO细胞与正常培养基（RM）和应激条件下（短期TBHP治疗）的对照组相比。数据表示三个独立实验的平均值（±标准偏差）(n个 = 9). 星号表示在有/无TBHP治疗的情况下，Ctrl与KO细胞的统计显著性，由学生确定t吨测试***第页 < 0.001.

**图4。CLN5疾病中自噬和有丝分裂机制的失调。**
一SH-SY5Y组线粒体（标记为TOMM20）和自噬体（标记为LC3）的结肠化显著增加*CLN5号机组*KO细胞（箭头，黄色荧光），与FCCP治疗强烈相关，以刺激有丝分裂（右图，20 µM FCCP）。比例尺，10 微米。b条以黄色荧光标记的LC3（绿色）和LAMP1（红色）的共同定位增加表明SH-SY5Y中的货物降解受到影响*CLN5号机组*KO细胞自噬体-溶酶体融合失调。DAPI（蓝色荧光）染色细胞核。比例尺，10 微米。一,b条显示三个独立细胞染色的代表性图像。**c（c）**对SH-SY5Y细胞自噬标记LC3的Western blotting分析表明，自噬通量水平（LC3BII/LC3BI比率）显著降低，添加20 µM催化裂化。数据表示三个独立实验的平均值（±标准偏差）(n个 = 9). 学生t吨测试。ns无统计学意义*第页 < 0.05; **第页 < 0.01***第页 < 0.001.

**图5。患者皮肤成纤维细胞的转化证实。**
一通过Western Blotting测定的CLN5蛋白水平显示，在Pt 2/F和11/M中完全缺乏CLN5免疫反应性，而在患者6/M中显示不同CLN5表达模式，可能是由于*CLN5号机组*突变作用于蛋白质合成。免疫化学研究表明，线粒体ATP合成酶（SCMAS）的c亚单位（NCL5的特征标记）存储在患者成纤维细胞的细胞内聚集物中。比例尺，10 微米。b条微氧描记轨迹显示OCR降低，注射FCCP后明显降低，反映出剩余呼吸能力不足。此外，在氧化条件下（用2-脱氧阻断糖酵解-d日-葡萄糖+丙酮酸），ATP含量降低，在突变更严重、蛋白质水平较低的患者中出现生物能量缺陷。葡萄糖用作ATP生成源；O寡霉素，用于阻断线粒体呼吸；2千克 + P（P） = 2-脱氧-d日-葡萄糖加丙酮酸，用于阻止糖酵解。**c（c）**成纤维细胞微丸用1.25%戊二醛和0.5%多聚甲醛固定在磷酸盐缓冲液中，后固定在1%四氧化锇中，并用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。异常细胞质模式明显，如液泡、致密体和溶酶体（A和B）数量增加所示。可以观察到具有不同超微结构排列的亲血性图形，包括蜂窝状结构（插入A），但无法检测到经典胞体。由单一膜勾勒出的几个液泡含有嗜锇物质，符合自噬过程的特征。在液泡中可以检测到具有多层结构的亲渗透内含物（插入B）。比例尺 = 1 微米；插入A，比例尺 = 0.2 微米；插入B，比例尺 = 0.3 微米。d日Western Blotting分析显示患者成纤维细胞中p62的表达显著增加，与自噬体-溶酶体成熟受阻相一致。数据表示三个独立实验的平均值（±标准偏差）(n个 = 9). 统计显著性由学生确定t吨测试*第页 < 0.05; **第页 < 0.01***第页 < 0.001.

**图6。CLN5疾病模型和患者材料下确定过程的示意图。**
功能研究证实了对差异表达线粒体蛋白的生物信息学分析，这些差异表达的线粒体蛋白将CLN5的缺乏与氧化应激、生物能量损伤和导致有丝分裂过程激活的自噬诱导联系起来。

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